| 摘要 | 第10-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 缩率词表 | 第17-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-32页 |
| 1 病原学研究进展 | 第19-24页 |
| 1.1 命名与分类地位 | 第19页 |
| 1.2 生物学特性 | 第19-20页 |
| 1.3 血清型 | 第20-21页 |
| 1.4 分子生物学研究进展 | 第21-24页 |
| 1.4.1 质粒 | 第21-22页 |
| 1.4.2 耐药性相关基因 | 第22页 |
| 1.4.3 毒力因子 | 第22-24页 |
| 2 铁和细菌 | 第24-27页 |
| 3 铁摄取调节蛋白 | 第27-30页 |
| 3.1 Fur蛋白的调控功能 | 第27页 |
| 3.2 Fur蛋白的调控机制 | 第27-29页 |
| 3.2.1 Fur蛋白的负调控机制 | 第27-28页 |
| 3.2.2 apo-Fur调控机制 | 第28-29页 |
| 3.3 Fur-box | 第29-30页 |
| 4 负筛选标记 | 第30-32页 |
| 第二章 鸭疫里氏杆菌FUR基因无抗性基因缺失突变株和回复株的构建 | 第32-79页 |
| 1 目的和意义 | 第32页 |
| 2 材料 | 第32-35页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第32-33页 |
| 2.2 主要分子生物学及生化试剂 | 第33页 |
| 2.2.1 工具酶 | 第33页 |
| 2.2.2 试剂盒 | 第33页 |
| 2.2.3 生化试剂 | 第33页 |
| 2.3 主要溶液的配制 | 第33-34页 |
| 2.3.1 抗生素类 | 第33-34页 |
| 2.3.2 培养基 | 第34页 |
| 2.3.3 琼脂糖凝胶电泳试剂 | 第34页 |
| 2.3.4 其它试剂 | 第34页 |
| 2.4 实验动物 | 第34页 |
| 2.5 主要仪器设备 | 第34-35页 |
| 3 试验方法 | 第35-56页 |
| 3.1 自杀性质粒pRE-lacZ-mpheS-spc的构建 | 第36-49页 |
| 3.1.1 筛选标记pheS的克隆与鉴定 | 第36-40页 |
| 3.1.2 指示标记lacZ的克隆与鉴定 | 第40-42页 |
| 3.1.3 pRE片段的克隆与鉴定 | 第42-44页 |
| 3.1.4 多克隆位点(MCS)的合成 | 第44页 |
| 3.1.5 pRE-MCS质粒的构建与鉴定 | 第44-45页 |
| 3.1.6 spc的克隆构建 | 第45-46页 |
| 3.1.7 筛选标记mpheS-spc的克隆与鉴定 | 第46-47页 |
| 3.1.8 pRE-mpheS-spc质粒的构建与鉴定 | 第47-48页 |
| 3.1.9 pRE-lacZ-mpheS-spc质粒的构建与鉴定 | 第48-49页 |
| 3.2 RA-YM株fur基因无抗性基因缺失突变株△fur的构建 | 第49-52页 |
| 3.2.1 自杀性质粒pRE-lacZ-mpheS-spc-fur的构建与鉴定 | 第49-51页 |
| 3.2.2 fur基因杂合体菌株的筛选与鉴定 | 第51页 |
| 3.2.3 fur基因无抗性基因缺失突变株RA-YMΔfur的筛选与鉴定 | 第51-52页 |
| 3.3 穿梭质粒pRES-JX-spc的构建与鉴定 | 第52-54页 |
| 3.3.1 pRA-JX复制区的克隆 | 第52-53页 |
| 3.3.2 穿梭质粒pRES-spc的构建与鉴定 | 第53页 |
| 3.3.3 穿梭质粒pRES-JX-spc的构建与鉴定 | 第53-54页 |
| 3.4 回复株CΔfur的构建与鉴定 | 第54-55页 |
| 3.4.1 穿梭质粒pRES-JX-spc-fur的构建与鉴定 | 第54-55页 |
| 3.4.2 回复株CΔfur的构建与鉴定 | 第55页 |
| 3.5 RA-YMΔfur基因缺失突变株致病性的研究 | 第55-56页 |
| 3.5.1 半数致死量LD50的测定 | 第55-56页 |
| 3.5.2 血液和组织载菌量的测定 | 第56页 |
| 3.5.3 RA-YMΔfur基因缺失突变株感染雏鸭后病理组织学观察 | 第56页 |
| 4 结果与分析 | 第56-76页 |
| 4.1 自杀性质粒pRE-lacZ-mpheS-spc的构建 | 第56-63页 |
| 4.1.1 负筛选标记pheS的克隆与鉴定 | 第56-59页 |
| 4.1.2 指示标记lacZ的克隆与鉴定 | 第59页 |
| 4.1.3 质粒pRE的构建与鉴定 | 第59-60页 |
| 4.1.4 pRE-MCS质粒的构建与鉴定 | 第60页 |
| 4.1.5 spc的克隆与鉴定 | 第60-61页 |
| 4.1.6 筛选标记mpheS-spc的克隆与鉴定 | 第61-62页 |
| 4.1.7 pRE-mpheS-spc质粒的构建与鉴定 | 第62页 |
| 4.1.8 pRE-lacZ-mpheS-spc质粒的构建与鉴定 | 第62-63页 |
| 4.2 fur基因无抗性基因缺失突变株RA-YMΔfur的构建 | 第63-67页 |
| 4.2.1 自杀性质粒pRE-lacZ-mpheS-spc-fur的构建与鉴定 | 第63-64页 |
| 4.2.2 fur基因杂合体菌株的筛选与鉴定 | 第64-66页 |
| 4.2.3 fur基因无抗性基因突变株RA-YMΔfur的筛选与鉴定 | 第66-67页 |
| 4.3 穿梭质粒pRES-JX-spc的构建与鉴定 | 第67-68页 |
| 4.3.1 pRA-JX复制区的克隆与鉴定 | 第67页 |
| 4.3.2 穿梭质粒pRES-spc的构建与鉴定 | 第67-68页 |
| 4.3.3 穿梭质粒pRES-JX-spc的构建与鉴定 | 第68页 |
| 4.4 回复株CΔfur的构建与鉴定 | 第68-70页 |
| 4.4.1 穿梭质粒pRES-JX-spc-fur的构建与鉴定 | 第68-69页 |
| 4.4.2 回复株CΔfur的构建与鉴定 | 第69-70页 |
| 4.5 RA-YMΔfur基因缺失突变株致病性的研究 | 第70-76页 |
| 4.5.1 RA-YMΔfur基因缺失突变株LD50的测定结果 | 第70-71页 |
| 4.5.2 血液和组织载菌量的测定结果 | 第71-72页 |
| 4.5.3 RA-YMΔfur基因缺失突变株感染雏鸭后病理组织学观察 | 第72-76页 |
| 5 讨论 | 第76-78页 |
| 5.1 筛选标记pheS和lacZ | 第76-77页 |
| 5.2 鸭疫里氏杆菌无抗性基因缺失系统及回复系统的构建 | 第77-78页 |
| 5.3 fur基因缺失对RA-YM株致病性的影响 | 第78页 |
| 6 结论 | 第78-79页 |
| 第三章 鸭疫里氏杆菌转录调控因子FUR调控功能的研究 | 第79-105页 |
| 1 目的和意义 | 第79页 |
| 2 材料 | 第79-80页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第79页 |
| 2.2 主要分子生物学及生化试剂 | 第79页 |
| 2.2.1 工具酶及主要试剂 | 第79页 |
| 2.2.2 试剂盒 | 第79页 |
| 2.3 主要溶液的配制 | 第79-80页 |
| 3 试验方法 | 第80-88页 |
| 3.1 RA-YM菌株和Δfur菌株RNA的提取 | 第81-82页 |
| 3.2 转录组测序 | 第82-83页 |
| 3.3 Real-timeRT-PCR验证差异表达基因 | 第83-85页 |
| 3.3.1 cDNA的合成 | 第83-84页 |
| 3.3.2 Real-timeRT-PCR | 第84-85页 |
| 3.4 Fur蛋白基因的克隆以及蛋白的表达与纯化 | 第85-87页 |
| 3.4.1 Fur蛋白基因的克隆 | 第85-86页 |
| 3.4.2 表达质粒pET28a-fur的构建与鉴定 | 第86页 |
| 3.4.3 Fur蛋白的诱导表达 | 第86页 |
| 3.4.4 Fur蛋白的纯化 | 第86-87页 |
| 3.5 鸭疫里氏杆菌Fur-box序列的预测 | 第87页 |
| 3.6 凝胶迁移实验鉴定Fur直接调控基因 | 第87-88页 |
| 3.6.1 生物素标记的启动子片段的扩增 | 第87页 |
| 3.6.2 凝胶迁移实验(EMSA) | 第87-88页 |
| 4 结果与分析 | 第88-102页 |
| 4.1 RA-YM菌株和RA-YMΔfur菌株RNA的提取 | 第88-89页 |
| 4.2 转录组测序结果 | 第89-92页 |
| 4.2.1 测序结果评估 | 第89-91页 |
| 4.2.2 限铁条件下,表达上调基因 | 第91-92页 |
| 4.2.3 限铁条件下,表达下调基因 | 第92页 |
| 4.2.4 Fur调控基因 | 第92页 |
| 4.3 Fur蛋白的表达与纯化 | 第92-94页 |
| 4.3.1 Fur蛋白基因的克隆 | 第92-93页 |
| 4.3.2 pET28a-fur质粒的构建与鉴定 | 第93页 |
| 4.3.3 Fur蛋白的表达及纯化 | 第93-94页 |
| 4.4 Fur-box序列的预测 | 第94页 |
| 4.5 凝胶迁移实验鉴定Fur直接调控基因 | 第94-102页 |
| 4.5.1 生物素标记的启动子片段的扩增 | 第94-95页 |
| 4.5.2 凝胶迁移实验(EMSA)结果 | 第95-102页 |
| 5 讨论 | 第102-104页 |
| 5.1 限铁条件下表达上调基因 | 第102-103页 |
| 5.2 限铁条件下表达下调基因 | 第103页 |
| 5.3 Fur调控基因 | 第103-104页 |
| 5.4 Fur-box序列 | 第104页 |
| 6 结论 | 第104-105页 |
| 结论 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-120页 |
| 科研成果 | 第120-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
