| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-34页 |
| 1.1 三七药理作用研究进展 | 第18-22页 |
| 1.1.1 对血液系统的影响 | 第18-19页 |
| 1.1.1.1 止血作用 | 第18页 |
| 1.1.1.2 活血化瘀和抗血栓的作用 | 第18-19页 |
| 1.1.1.3 补血、造血功能 | 第19页 |
| 1.1.2 对心脑血管系统的影响 | 第19-21页 |
| 1.1.2.1 降血压、降血脂,预防动脉粥样硬化 | 第19-20页 |
| 1.1.2.2 抗心律失常 | 第20页 |
| 1.1.2.3 降低心肌耗氧量,改善心肌缺血 | 第20-21页 |
| 1.1.2.4 降血糖 | 第21页 |
| 1.1.3 抗肿瘤作用 | 第21-22页 |
| 1.2 三七皂苷的生物合成途径及其关键酶 | 第22-26页 |
| 1.2.1 三七皂苷的生物合成途径 | 第22-23页 |
| 1.2.2 三七皂苷生物合成关键酶 | 第23-26页 |
| 1.2.2.1 法尼基焦磷酸合成酶(FPS) | 第23-24页 |
| 1.2.2.2 鲨烯合成酶(SS) | 第24-25页 |
| 1.2.2.3 鲨烯环氧酶(SE) | 第25页 |
| 1.2.2.4 达玛烯二醇合酶(DS) | 第25-26页 |
| 1.2.2.5 其他关键酶 | 第26页 |
| 1.3 药用植物HMGR研究进展 | 第26-31页 |
| 1.3.1 植物HMGR的结构分析 | 第26-27页 |
| 1.3.2 植物HMGR的表达调控 | 第27-28页 |
| 1.3.3 部分药用植物HMGR的克隆和功能分析 | 第28-31页 |
| 1.3.3.1 丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge) | 第28-29页 |
| 1.3.3.2 人参(Panαx ginseng C.A.Meyer) | 第29页 |
| 1.3.3.3 甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.) | 第29-30页 |
| 1.3.3.4 杜仲(Eucommia ulmoides Oliver) | 第30页 |
| 1.3.3.5 棒子(Corylus avellanaL.Gasaway) | 第30-31页 |
| 1.3.3.6 桑(Morus alba Linn.) | 第31页 |
| 1.3.3.7 刺五加(Acanthopanax senticosus (Rupr. et Maxim.) Harms) | 第31页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第31-33页 |
| 1.5 实验技术路线 | 第33-34页 |
| 第二章 三七HMGR功能基因的克隆和表达分析 | 第34-56页 |
| 2.1 前言 | 第34页 |
| 2.2 材料和试剂 | 第34-36页 |
| 2.2.1 植物材料 | 第34页 |
| 2.2.2 菌株和载体 | 第34-35页 |
| 2.2.3 试剂 | 第35-36页 |
| 2.2.4 缓冲液和培养基 | 第36页 |
| 2.3 实验方法 | 第36-44页 |
| 2.3.1 三七总RNA的提取与纯化 | 第36-37页 |
| 2.3.2 cDNA的合成 | 第37页 |
| 2.3.3 PnHMGR基因cDNA的扩增 | 第37-38页 |
| 2.3.4 PCR产物胶回收 | 第38-39页 |
| 2.3.5 T-A克隆 | 第39页 |
| 2.3.6 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第39-40页 |
| 2.3.7 PnHMGR的生物信息学分析 | 第40页 |
| 2.3.8 实时荧光定量PCR | 第40-41页 |
| 2.3.9 三七愈伤组织总皂苷含量测定 | 第41-43页 |
| 2.3.9.1 标准曲线的制备 | 第41-42页 |
| 2.3.9.2 三七愈伤组织中总皂苷含量的测定 | 第42-43页 |
| 2.3.10 质粒提取及纯化 | 第43页 |
| 2.3.11 双酶切反应 | 第43-44页 |
| 2.3.12 酶切产物胶回收 | 第44页 |
| 2.3.13 DNA连接反应 | 第44页 |
| 2.3.14 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第44页 |
| 2.3.15 pCAMBIA1300S- PnHMGR重组质粒的筛选和鉴定 | 第44页 |
| 2.4 结果与分析 | 第44-54页 |
| 2.4.1 三七总RNA的提取 | 第44-45页 |
| 2.4.2 三七PnHMGR基因的克隆 | 第45-46页 |
| 2.4.3 PnHMGR编码蛋白序列相似性分析 | 第46页 |
| 2.4.4 PnHMGR编码蛋白的理化性质分析 | 第46页 |
| 2.4.5 PnHMGR编码蛋白二级结构分析及三级结构预测 | 第46-47页 |
| 2.4.6 PnHMGR编码蛋白信号肽、亚细胞定位、跨膜区预测分析 | 第47-48页 |
| 2.4.7 PnHMGR编码蛋白的功能结构域预测和分析 | 第48-50页 |
| 2.4.8 PnHMGR编码蛋白的系统进化树分析 | 第50-51页 |
| 2.4.9 PnHMGR基因在三七愈伤组织不同生长阶段的表达分析 | 第51-52页 |
| 2.4.10 PnHMGR植物超表达载体的构建 | 第52-54页 |
| 2.5 讨论 | 第54-56页 |
| 第三章 根癌农杆菌介导的PnHMGR基因的遗传转化 | 第56-72页 |
| 3.1 前言 | 第56页 |
| 3.2 材料和试剂 | 第56-58页 |
| 3.2.1 植物材料 | 第56页 |
| 3.2.2 菌种 | 第56页 |
| 3.2.3 试剂 | 第56-57页 |
| 3.2.4 缓冲液和培养基 | 第57-58页 |
| 3.3 实验方法 | 第58-62页 |
| 3.3.1 质粒提取和纯化 | 第58页 |
| 3.3.2 制备根癌农杆菌感受态 | 第58页 |
| 3.3.3 表达载体pCAMBIA1300s-PnHMGR转化农杆菌感受态细胞 | 第58-59页 |
| 3.3.4 pCAMBIA1300s-PnHMGR转化农杆菌的菌液PCR鉴定 | 第59页 |
| 3.3.5 农杆菌介导的三七遗传转化 | 第59-60页 |
| 3.3.5.1 农杆菌的活化 | 第59页 |
| 3.3.5.2 农杆菌介导的遗传转化 | 第59-60页 |
| 3.3.6 转基因三七细胞系的分子检测 | 第60-61页 |
| 3.3.6.1 CTAB法提取基因组DNA | 第60页 |
| 3.3.6.2 PCR检测 | 第60-61页 |
| 3.3.6.3 阳性转基因细胞荧光定量PCR检测 | 第61页 |
| 3.3.7 PnHMGR酶活测定 | 第61-62页 |
| 3.4 实验结果与分析 | 第62-68页 |
| 3.4.1 PnHMGR农杆菌转化子的鉴定 | 第62-63页 |
| 3.4.2 转基因三七细胞系的基因组PCR检测 | 第63-65页 |
| 3.4.3 转基因细胞系的荧光定量PCR检测 | 第65-67页 |
| 3.4.3.1 愈伤组织总RNA提取 | 第65页 |
| 3.4.3.2 qRT-PCR检测 | 第65-67页 |
| 3.4.4 转基因细胞系的PnHMGR酶活测定 | 第67-68页 |
| 3.5 讨论 | 第68-72页 |
| 第四章 转基因三七细胞次级代谢物含量测定 | 第72-82页 |
| 4.1 前言 | 第72页 |
| 4.2 材料和试剂 | 第72页 |
| 4.2.1 植物材料 | 第72页 |
| 4.2.2 试剂 | 第72页 |
| 4.3 实验方法 | 第72-75页 |
| 4.3.1 三七愈伤组织中总皂苷含量的测定 | 第72页 |
| 4.3.2 三七愈伤组织中单体皂苷含量的测定 | 第72-74页 |
| 4.3.3 三七愈伤组织中植物甾醇含量的测定 | 第74-75页 |
| 4.4 实验结果和分析 | 第75-80页 |
| 4.4.1 三七愈伤组织中皂苷含量的测定 | 第75-77页 |
| 4.4.2 三七愈伤组织中单体皂苷含量的测定 | 第77-78页 |
| 4.4.3 三七愈伤组织中植物甾醇含量的测定 | 第78-80页 |
| 4.5 讨论 | 第80-82页 |
| 第五章 结论和展望 | 第82-86页 |
| 5.1 结论 | 第82-83页 |
| 5.2 展望 | 第83-86页 |
| 致谢 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-102页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表文章目录 | 第102页 |
