| 摘要 | 第5-7页 |
| SUMMARY | 第7-9页 |
| 第1章 引言 | 第14-28页 |
| 1.1 痘苗病毒的应用 | 第14-17页 |
| 1.1.1 痘苗病毒作为天花疫苗 | 第14-15页 |
| 1.1.2 痘苗病毒作为疫苗载体 | 第15-17页 |
| 1.1.3 痘苗病毒作为溶瘤病毒 | 第17页 |
| 1.2 痘苗病毒载体改造 | 第17-20页 |
| 1.2.1 痘苗病毒的减毒改造 | 第18-19页 |
| 1.2.2 提高免疫原性的改造 | 第19-20页 |
| 1.3 痘苗病毒EEV的释放与相关基因 | 第20-25页 |
| 1.3.1 痘苗病毒的基本生物学特征 | 第20-21页 |
| 1.3.2 痘苗病毒EEV的释放 | 第21-22页 |
| 1.3.3 痘苗病毒EEV释放相关基因 | 第22-24页 |
| 1.3.4 EEV在病毒感染和免疫应答诱导中的优势 | 第24-25页 |
| 1.4 本课题的研究目的及实验设计 | 第25-28页 |
| 第2章 材料与方法 | 第28-58页 |
| 2.1 实验仪器、试剂和耗材 | 第28-35页 |
| 2.1.1 实验仪器 | 第28-29页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第29-30页 |
| 2.1.3 耗材 | 第30-31页 |
| 2.1.4 生物材料 | 第31-32页 |
| 2.1.5 培养基、缓冲液及溶液配方 | 第32-35页 |
| 2.2 实验方法 | 第35-58页 |
| 2.2.1 细胞传代,复苏,冻存 | 第35-36页 |
| 2.2.2 质粒转染 | 第36-37页 |
| 2.2.3 HIV-1人源单克隆抗体10E8制备 | 第37页 |
| 2.2.4 Westernblot | 第37-38页 |
| 2.2.5 痘苗病毒的扩增/制备 | 第38页 |
| 2.2.6 痘苗病毒基因组提取 | 第38-39页 |
| 2.2.7 同源重组 | 第39页 |
| 2.2.8 噬斑筛选纯化重组病毒 | 第39-40页 |
| 2.2.9 病毒噬斑实验(plaqueassay) | 第40-41页 |
| 2.2.10 病毒生长曲线测定 | 第41页 |
| 2.2.11 噬斑免疫染色 | 第41-42页 |
| 2.2.12 Caco-2细胞的培养及Trans-well系统的铺置 | 第42页 |
| 2.2.13 重组痘苗病毒感染极化Caco-2细胞实验 | 第42-43页 |
| 2.2.14 小鼠免疫策略 | 第43-44页 |
| 2.2.15 小鼠血清与组织样的获取 | 第44-45页 |
| 2.2.16 痘苗病毒中和抗体滴度测定 | 第45-46页 |
| 2.2.17 小鼠脾淋巴细胞分离 | 第46-47页 |
| 2.2.18 酶联免疫斑点实验(ELISPOT) | 第47页 |
| 2.2.19 HIV-1假病毒中和实验 | 第47-48页 |
| 2.2.20 ELISA双抗体夹心法测定小鼠肌肉中的Env蛋白浓度 | 第48-49页 |
| 2.2.21 MTTassay | 第49页 |
| 2.2.22 ELISA检测小鼠血清中特异性抗体滴度 | 第49-50页 |
| 2.2.23 病毒RNA提取 | 第50-51页 |
| 2.2.24 荧光定量PCR | 第51-52页 |
| 2.2.25 穿梭载体构建 | 第52-57页 |
| 2.2.26 统计学分析 | 第57-58页 |
| 第3章 实验结果 | 第58-104页 |
| 3.1 重组克隆的构建 | 第58-60页 |
| 第一部分 基于病毒依赖微管的运输相关基因的天坛痘苗病毒改造 | 第60-70页 |
| 3.2 缺失A36R基因抑制病毒EEV释放 | 第60-64页 |
| 3.2.1 A36R/F12L基因缺失重组病毒的噬斑形态 | 第60-62页 |
| 3.2.2 重组克隆rVTT△A36R-GFP在细胞中的复制和EEV释放 | 第62-64页 |
| 3.3 重组克隆rVTT△A36R-GFP在极化的Caco-2上皮细胞中的释放 | 第64-65页 |
| 3.4 重组克隆rVTT△A36R-GFP在小鼠呼吸道黏膜的复制和分布特征 | 第65-67页 |
| 第一部分 小结 | 第67-70页 |
| 第二部分 基于病毒从细胞膜上解离相关基因的天坛痘苗病毒改造 | 第70-96页 |
| 3.5 A34R基因K151E点突变显著提高EEV的产生 | 第70-72页 |
| 3.5.1 重组病毒rVTT-A34Rmut释放更多EEV | 第70-71页 |
| 3.5.2 重组病毒rVTT-A34Rmut具有更低的细胞毒性 | 第71-72页 |
| 3.6 以rVTT-A34Rmut为载体的重组疫苗构建 | 第72-74页 |
| 3.7 重组病毒rVTT-A34Rmut-Env产生更多EEV和总子代病毒 | 第74-78页 |
| 3.7.1 重组病毒rVTT-A34Rmut-Env造成更多细胞感染 | 第74-75页 |
| 3.7.2 重组病毒rVTT-A34Rmut-Env在细胞中的复制及EEV释放 | 第75-78页 |
| 3.8 重组病毒rVTT-A34Rmut-Env显著增强目标抗原Env的表达水平 | 第78-83页 |
| 3.9 rVTT-A34Rmut-Env肌注免疫诱导更强的HIV特异性免疫应答 | 第83-87页 |
| 3.9.1 rVTT-A34Rmut-Env肌注免疫诱导更强的HIV特异性效应T细胞应答 | 第83-84页 |
| 3.9.2 rVTT-A34Rmut-Env肌注免疫诱导更强的HIV特异性抗体应答 | 第84-86页 |
| 3.9.3 rVTT-A34Rmut-Env肌注免疫诱导更强的HIV特异性中和抗体应答 | 第86-87页 |
| 3.10 rVTT-A34Rmut-Env肌注免疫诱导更强的VTT载体特异性免疫应答 | 第87-89页 |
| 3.11 rVTT-A34Rmut-Env在低免疫剂量下(1×106pfu)的免疫应答效应 | 第89-92页 |
| 3.12 rVTT-A34Rmut-Env具有良好的安全性 | 第92-94页 |
| 第二部分 小结 | 第94-96页 |
| 第三部分 ：A34R基因点突变改造方案在HIV候选疫苗VTKgpe中的应用 | 第96-104页 |
| 3.13 重组病毒VTKgpe-A34Rmut的构建 | 第96页 |
| 3.14 A34R点突变增强VTKgpe在Vero细胞中的EEV释放 | 第96-97页 |
| 3.15 VTKgpe-A34Rmut在小鼠中诱导更强的HIV特异性免疫应答 | 第97-101页 |
| 3.16 VTKgpe-A34Rmut具有良好的安全性 | 第101-103页 |
| 第三部分 小结 | 第103-104页 |
| 第4章 总结 | 第104-106页 |
| 第5章 讨论 | 第106-112页 |
| 5.1 痘苗病毒在极化黏膜上皮中的释放特性 | 第106-107页 |
| 5.2 痘苗病毒EEV释放增强对其细胞毒性和动物毒性的影响 | 第107-109页 |
| 5.3 预存载体特异抗体对重组VTT载体疫苗免疫应答效应的影响 | 第109-112页 |
| 参考文献 | 第112-120页 |
| 致谢 | 第120-122页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第122-123页 |
