| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-38页 |
| 1.1 中介体的背景介绍 | 第12-21页 |
| 1.1.1 中介体的作用 | 第12-13页 |
| 1.1.2 中介体的模块化结构及组成 | 第13-14页 |
| 1.1.3 中介体结构研究的现状 | 第14-16页 |
| 1.1.4 中介体和RNAPⅡ的结构以及相互作用研究进展 | 第16-17页 |
| 1.1.5 中介体的头部模块 | 第17-18页 |
| 1.1.6 中介体头部模块与RNAPⅡ的相互作用 | 第18-19页 |
| 1.1.7 中介体的中部模块 | 第19页 |
| 1.1.8 中介体的尾部模块 | 第19-20页 |
| 1.1.9 中介体的CDK8模块 | 第20页 |
| 1.1.10 椎体虫的中介体结构 | 第20-21页 |
| 1.2 冷冻电镜 | 第21-38页 |
| 1.2.1 电子显微三维重构技术的基本原理 | 第23-24页 |
| 1.2.2 单颗粒三维重构 | 第24-25页 |
| 1.2.3 电子断层三维重构 | 第25-26页 |
| 1.2.4 电镜样品的制备方法 | 第26-31页 |
| 1.2.4.1 生物样品的特殊性 | 第26-27页 |
| 1.2.4.2 负染的电镜样品制备方法 | 第27页 |
| 1.2.4.3 冷冻的电镜样品制备方法 | 第27-28页 |
| 1.2.4.4 电镜样品制备方法的改进和优化 | 第28-31页 |
| 1.2.4.4.1 冷冻-负染制备方法 | 第28页 |
| 1.2.4.4.2 GraFix方法 | 第28-30页 |
| 1.2.4.4.3 石墨烯代替碳膜 | 第30-31页 |
| 1.2.5 直接电子探测器的应用 | 第31-32页 |
| 1.2.6 电镜结构的亚基定位及建模 | 第32-34页 |
| 1.2.7 图像处理技术的发展和创新 | 第34-38页 |
| 1.2.7.1 二/三维图像处理的现状 | 第34-37页 |
| 1.2.7.2 图像处理技术的发展 | 第37-38页 |
| 第二章 中介体整体的结构和模块划分 | 第38-66页 |
| 2.1 酿酒酵母中介体的结构 | 第38-44页 |
| 2.1.1 酿酒酵母中介体的结构模型 | 第38-39页 |
| 2.1.2 酿酒酵母中介体的内源性纯化 | 第39-40页 |
| 2.1.3 酿酒酵母中介体的负染电镜照片 | 第40页 |
| 2.1.4 酿酒酵母中介体的三维结构的解析方法——RCT | 第40-44页 |
| 2.2 裂殖酵母中介体的结构 | 第44-47页 |
| 2.2.1 裂殖酵母中介体的纯化 | 第44-45页 |
| 2.2.2 裂殖酵母的负染电镜照片 | 第45-46页 |
| 2.2.3 裂殖酵母中介体的电镜结构 | 第46-47页 |
| 2.3 原来中介体模块划分的问题 | 第47-49页 |
| 2.4 酿酒酵母中介体的头部+中部模块 | 第49-53页 |
| 2.4.1 构建及纯化头部+中部模块 | 第49-51页 |
| 2.4.2 头部+中部模块的电镜结构 | 第51页 |
| 2.4.3 酿酒酵母中介体头部+中部模块的电镜结构 | 第51-53页 |
| 2.5 尾部模块的定位 | 第53-56页 |
| 2.6 头部、中部模块的定位 | 第56-62页 |
| 2.7 中介体和RNAPⅡ的相互作用 | 第62-63页 |
| 2.8 在转录起始前复合物组装过程中中介体功能及意义 | 第63-66页 |
| 第三章 Med14亚基介导的头部和中部模块相互作用 | 第66-86页 |
| 3.1 头部+中部模块的更精细的电镜结构 | 第66-69页 |
| 3.1.1 Med16亚基缺失构建头部+中部模块更精细结构 | 第66-67页 |
| 3.1.2 Med14亚基碳端缺失构建头部+中部模块 | 第67-69页 |
| 3.2 头部模块的精细结构 | 第69-74页 |
| 3.2.1 头部模块的纯化 | 第69-70页 |
| 3.2.2 头部模块的电镜结构 | 第70-71页 |
| 3.2.3 酿酒酵母中介体头部模块的电镜结构 | 第71-73页 |
| 3.2.4 头部模块的细致分析 | 第73-74页 |
| 3.3 中部模块的亚基定位 | 第74-81页 |
| 3.3.1 Med1亚基的定位 | 第74-77页 |
| 3.3.2 Med4、Med9亚基的定位 | 第77-79页 |
| 3.3.3 中部模块Med10、Med7C、Med21的亚基的定位 | 第79-81页 |
| 3.4 Med14的亚基定位以及其意义 | 第81-86页 |
| 3.4.1 Med14亚基对稳定中介体头部+中部模块起关键作用 | 第81-82页 |
| 3.4.2 Med19对稳定头部+中部模块相互作用的辅助作用 | 第82页 |
| 3.4.3 结构和质谱交联的数据比较 | 第82页 |
| 3.4.4 Med14亚基的定位 | 第82-86页 |
| 第四章 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块 | 第86-106页 |
| 4.1 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的结构 | 第86-92页 |
| 4.1.1 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的背景 | 第86-87页 |
| 4.1.2 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的纯化 | 第87页 |
| 4.1.3 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的电镜照片 | 第87-88页 |
| 4.1.4 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的二维结构 | 第88-89页 |
| 4.1.5 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的三维结构 | 第89-92页 |
| 4.2 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的亚基定位 | 第92-96页 |
| 4.2.1 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的亚基缺失定位 | 第92-94页 |
| 4.2.2 酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的亚基金颗粒标记定位 | 第94-95页 |
| 4.2.3 人源的CDK8模块的Cdk8-CcyC亚复合物对接到酿酒酵母中介体CDK8激酶模块的结构 | 第95-96页 |
| 4.3 体内CDK8模块和中介体相互作用的研究 | 第96-100页 |
| 4.3.1 以中介体为标记的免疫共沉淀实验 | 第97-98页 |
| 4.3.2 以CDK8模块为标记的免疫共沉淀实验 | 第98-100页 |
| 4.4 体外CDK8模块和中介体相互作用的研究 | 第100-106页 |
| 4.4.1 体外中介体的二维结构 | 第100页 |
| 4.4.2 体外中介体和RNAPⅡ的相互作用 | 第100-101页 |
| 4.4.3 体外中介体和CDK8模块的相互作用 | 第101-106页 |
| 第五章 实验材料和方法 | 第106-124页 |
| 5.1 实验材料 | 第106页 |
| 5.1.1 表达带有标签的中介体复合体 | 第106页 |
| 5.1.2 表达带有标签的中介体亚复合物 | 第106页 |
| 5.2 中介体及其亚复合物的纯化 | 第106-115页 |
| 5.2.1 酵母克隆的构建 | 第107-108页 |
| 5.2.1.1 扩增标签和筛选标记 | 第107页 |
| 5.2.1.2 酵母感受态细胞的制备 | 第107-108页 |
| 5.2.1.3 酵母细胞的转化 | 第108页 |
| 5.2.2 目的蛋白的表达和检测 | 第108-110页 |
| 5.2.2.1 酵母细胞总蛋白的提取 | 第108-109页 |
| 5.2.2.2 Western Blotting检测目的蛋白 | 第109-110页 |
| 5.2.3 酵母细胞的扩大培养 | 第110-111页 |
| 5.2.4 酵母蛋白的纯化及检测 | 第111-115页 |
| 5.2.4.1 IgG亲和层析柱初步纯化 | 第111-113页 |
| 5.2.4.2 进一步用离子交换纯化 | 第113-114页 |
| 5.2.4.3 蛋白纯化结果的检测 | 第114-115页 |
| 5.3 电镜观察与数据收集 | 第115-120页 |
| 5.3.1 电镜样品的制备 | 第115页 |
| 5.3.2 电镜的基本操作 | 第115-118页 |
| 5.3.3 RCT (random-conical tilt)方法 | 第118-120页 |
| 5.3.3.1 RCT方法的原理简介 | 第118-119页 |
| 5.3.3.2 RCT的数据收集 | 第119-120页 |
| 5.4 电镜图像处理 | 第120-122页 |
| 5.4.1 RCT的单颗粒挑选 | 第120页 |
| 5.4.2 单颗粒的二维分析 | 第120-121页 |
| 5.4.3 单颗粒的三维重构 | 第121-122页 |
| 5.5 中介体亚基定位——纳米金颗粒标记 | 第122-124页 |
| 5.5.1 样品与纳米金颗粒孵育 | 第122页 |
| 5.5.2 电镜观察与数据收集 | 第122页 |
| 5.5.3 纳米金颗粒标记的图像处理 | 第122-124页 |
| 全文总结 | 第124-126页 |
| 博士论文创新点 | 第126-128页 |
| 参考文献 | 第128-138页 |
| 致谢 | 第138-140页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第140页 |
