| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-32页 |
| 1.1 蛋白质泛素化修饰 | 第14-22页 |
| 1.1.1 蛋白泛素化系统简介 | 第14-15页 |
| 1.1.2 E1泛素活化酶 | 第15页 |
| 1.1.3 E2泛素结合酶 | 第15-19页 |
| 1.1.3.1 E2泛素结合酶的结构和分类 | 第15-17页 |
| 1.1.3.2 E2泛素结合酶参与泛素化修饰的生化特性 | 第17-18页 |
| 1.1.3.3 植物中E2泛素结合酶的功能研究进展 | 第18-19页 |
| 1.1.4 E3泛素连接酶 | 第19-21页 |
| 1.1.5 26S蛋白酶体和去泛素化酶DUB | 第21-22页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系统 | 第22-31页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9系统的发现 | 第22-23页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9系统的工作原理 | 第23-24页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9系统的升级改造 | 第24-25页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9系统在植物中的应用 | 第25-28页 |
| 1.2.4.1 创建基因突变体材料 | 第25-26页 |
| 1.2.4.2 创造染色体大片段缺失、替换和插入材料 | 第26-27页 |
| 1.2.4.3 培育无筛选标记的转基因材料 | 第27页 |
| 1.2.4.4 单碱基编辑实现植物的精准修饰 | 第27-28页 |
| 1.2.5 CRISPR/Cas9系统的脱靶研究 | 第28-29页 |
| 1.2.6 改善CRISPR/Cas9系统脱靶的方法 | 第29-31页 |
| 1.3 研究目的与意义 | 第31-32页 |
| 第二章 GhUBC2L基因功能验证 | 第32-67页 |
| 2.1 材料与方法 | 第32-43页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第32页 |
| 2.1.2 实验方法 | 第32-43页 |
| 2.1.2.1 棉花E2基因家族进化和表达分析 | 第32-33页 |
| 2.1.2.2 GhUBC2L基因的克隆及序列分析 | 第33页 |
| 2.1.2.3 GhUBC2L超表达和干涉载体的构建 | 第33-34页 |
| 2.1.2.4 棉花的遗传转化 | 第34页 |
| 2.1.2.5 DNA提取和Southern blotting | 第34-36页 |
| 2.1.2.6 RNA提取和目的基因表达量检测 | 第36-37页 |
| 2.1.2.7 石蜡切片 | 第37-38页 |
| 2.1.2.8 转基因材料叶片生长曲线考察 | 第38页 |
| 2.1.2.9 转基因材料花瓣细胞大小统计 | 第38页 |
| 2.1.2.10 转基因材料叶片和花瓣中激素测定 | 第38页 |
| 2.1.2.11 GhUBC2L亚细胞定位 | 第38-39页 |
| 2.1.2.12 酵母双杂交筛选 | 第39页 |
| 2.1.2.13 原核表达和蛋白纯化 | 第39-40页 |
| 2.1.2.14 GSTpulldown | 第40-41页 |
| 2.1.2.15 BiFC及荧光素酶互补成像分析 | 第41页 |
| 2.1.2.16 E2泛素结合酶及E3泛素连接酶活性实验 | 第41-42页 |
| 2.1.2.17 泛素化蛋白组测定 | 第42-43页 |
| 2.1.2.18 组蛋白H2Bub和H3K4me3修饰水平的检测 | 第43页 |
| 2.2 结果与分析 | 第43-61页 |
| 2.2.1 棉花中E2基因家族进化和组织表达模式分析 | 第43-47页 |
| 2.2.2 GhUBC2L基因的克隆 | 第47页 |
| 2.2.3 GhUBC2L及其同源基因的组织表达模式分析 | 第47-50页 |
| 2.2.4 GhUBC2L超表达和干涉株系的获得和检测 | 第50-51页 |
| 2.2.5 GhUBC2L参与调控棉花器官大小发育 | 第51-53页 |
| 2.2.6 GhUBC2L影响棉花种子和纤维的发育 | 第53-54页 |
| 2.2.7 GhUBC2L调控细胞增殖和膨大 | 第54-55页 |
| 2.2.8 GhUBC2L具有E2泛素结合酶活性 | 第55页 |
| 2.2.9 GhUBC2L与具有E3连接酶活性的GhUbox8蛋白互作 | 第55-59页 |
| 2.2.10 GhUBC2L下调表达显著降低棉花中的蛋白泛素化修饰水平 | 第59页 |
| 2.2.11 GhUBC2L干涉株系中H2Bub和H3K4me3修饰水平显著降低 | 第59-61页 |
| 2.2.12 GhUBC2L可能影响多个激素响应路径 | 第61页 |
| 2.3 讨论 | 第61-67页 |
| 第三章 棉花CRISPR/Cas9系统的建立 | 第67-92页 |
| 3.1 材料与方法 | 第67-71页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第67页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第67-71页 |
| 3.1.2.1 棉花U6启动子克隆 | 第67页 |
| 3.1.2.2 适用于棉花的CRISPR/Cas9载体改造 | 第67-68页 |
| 3.1.2.3 GhCLA1和DsRED2基因敲除表达载体的构建 | 第68页 |
| 3.1.2.4 棉花的遗传转化 | 第68页 |
| 3.1.2.5 DsRED2敲除材料的荧光观察 | 第68页 |
| 3.1.2.6 DNA提取和Southern blotting | 第68-69页 |
| 3.1.2.7 PCR和靶标位点突变检测 | 第69页 |
| 3.1.2.8 T7E1酶切鉴定 | 第69-70页 |
| 3.1.2.9 Barcode设计和高通量测序 | 第70页 |
| 3.1.2.10 脱靶位点检测 | 第70-71页 |
| 3.1.2.11 数据分析 | 第71页 |
| 3.2 结果与分析 | 第71-89页 |
| 3.2.1 启动子pGhU6.9的克隆和表达载体的改造 | 第71-73页 |
| 3.2.2 靶标基因GhCLA1和DsRED2基因序列分析及sgRNA设计 | 第73-76页 |
| 3.2.3 T0代DsRED2基因敲除材料表型和突变鉴定 | 第76-77页 |
| 3.2.4 T0代GhCLA1基因敲除材料表型鉴定 | 第77-78页 |
| 3.2.5 Sanger测序鉴定胚性愈伤阶段的GhCLA1突变 | 第78-79页 |
| 3.2.6 T7E1酶切可用于突变材料筛选 | 第79-81页 |
| 3.2.7 双靶点突变产生大片段缺失突变体 | 第81-82页 |
| 3.2.8 完全白化单株表型源于GhCLA1位点的纯合突变 | 第82-84页 |
| 3.2.9 CRISPR/Cas9系统在棉花中具有高效性 | 第84页 |
| 3.2.10 CRISPR/Cas9产生的基因突变能够遗传到T1代 | 第84-86页 |
| 3.2.11 CRISPR/Cas9系统在棉花中没有产生脱靶效应 | 第86页 |
| 3.2.12 依赖Barcode标记的高通量测序提高突变材料检测效率 | 第86-89页 |
| 3.3 讨论 | 第89-92页 |
| 参考文献 | 第92-109页 |
| 附录 | 第109-126页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第126-127页 |
| 致谢 | 第127-129页 |
