| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 绪论 | 第11-19页 |
| 1.1 抗菌肽概述 | 第11-15页 |
| 1.1.1 抗菌肽的分类及特性 | 第11-12页 |
| 1.1.2 抗菌肽的作用机制 | 第12-13页 |
| 1.1.3 抗菌肽转基因表达策略 | 第13-14页 |
| 1.1.4 抗菌肽的分离纯化方法 | 第14页 |
| 1.1.5 抗菌肽的应用 | 第14-15页 |
| 1.2 植酸酶概述 | 第15-17页 |
| 1.2.1 植酸酶来源及转基因表达策略 | 第16页 |
| 1.2.2 植酸酶的应用 | 第16-17页 |
| 1.3 酵母异源表达系统 | 第17-18页 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统 | 第17-18页 |
| 1.3.2 乳酸克鲁维酵母表达系统 | 第18页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 2 臭蛙抗菌肽基因合成及酵母异源表达 | 第19-37页 |
| 2.1 材料与方法 | 第19-20页 |
| 2.1.1 质粒及菌株 | 第19页 |
| 2.1.2 仪器和试剂 | 第19页 |
| 2.1.3 培养基 | 第19-20页 |
| 2.2 臭蛙抗菌肽基因序列的设计与合成 | 第20页 |
| 2.3 毕赤酵母基因工程菌株的构建 | 第20-29页 |
| 2.3.1 构建重组质粒及转化毕赤酵母菌株 | 第20-24页 |
| 2.3.2 阳性转化子的诱导培养 | 第24页 |
| 2.3.3 检测抗菌肽活性 | 第24-25页 |
| 2.3.4 抗菌肽生物效价测定 | 第25页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE鉴定抗菌肽 | 第25-27页 |
| 2.3.6 重组菌株的NTG诱变 | 第27页 |
| 2.3.7 影响抗菌肽odoranagin效价的因素 | 第27-28页 |
| 2.3.8 数据统计与分析 | 第28-29页 |
| 2.4 实验结果 | 第29-37页 |
| 2.4.1 重组表达质粒pPICOG的鉴定 | 第29-30页 |
| 2.4.2 菌株的转化与筛选 | 第30-31页 |
| 2.4.3 重组酵母菌株的生长情况测定 | 第31-32页 |
| 2.4.4 重组酵母菌株质粒丢失率测定 | 第32-33页 |
| 2.4.5 NTG诱变筛选重组表达稳定及高产菌株 | 第33-34页 |
| 2.4.6 酵母重组菌株OGmu13发酵条件的优化 | 第34-36页 |
| 2.4.7 SDS-PAGE分析重组菌产抗菌肽odoranagin | 第36页 |
| 2.4.8 抗菌肽odoranagin的耐热性研究 | 第36-37页 |
| 3 产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母高密度发酵及产物的分离纯化 | 第37-49页 |
| 3.1 材料与方法 | 第37-39页 |
| 3.1.1 材料 | 第37页 |
| 3.1.2 重组乳酸克鲁维酵母基因工程菌PN21高密度发酵 | 第37-38页 |
| 3.1.3 抗菌肽生物效价及产量检测 | 第38页 |
| 3.1.4 响应面法优化发酵条件 | 第38页 |
| 3.1.5 数据统计 | 第38页 |
| 3.1.6 发酵产物的分离纯化 | 第38-39页 |
| 3.1.7 SDS-PAGE检测 | 第39页 |
| 3.2 结果与分析 | 第39-49页 |
| 3.2.1 重组抗菌肽PSI乳酸克鲁维酵母基因工程菌高密度发酵 | 第39-40页 |
| 3.2.2 不同发酵培养基对抗菌肽表达量的影响 | 第40-41页 |
| 3.2.3 葡萄糖添加量、流加速度对菌体生长的影响 | 第41-42页 |
| 3.2.4 乳糖或半乳糖诱导对抗菌肽产量的影响 | 第42页 |
| 3.2.5 诱导重组菌抗菌肽表达条件的优化 | 第42-43页 |
| 3.2.6 重组菌抗菌肽表达条件的响应面法优化 | 第43-47页 |
| 3.2.7 发酵液中抗菌肽PSI的分离纯化 | 第47-49页 |
| 4 植酸酶基因克隆及在酵母中异源表达的研究 | 第49-61页 |
| 4.1 材料与方法 | 第49-54页 |
| 4.1.1 材料 | 第49页 |
| 4.1.2 基因组DNA提取 | 第49-50页 |
| 4.1.3 青霉植酸酶phyA基因的PCR扩增 | 第50页 |
| 4.1.4 表达载体pKLAC-phy的构建 | 第50-52页 |
| 4.1.5 重组质粒pPIC9K-phy电击转化酵母细胞 | 第52-53页 |
| 4.1.6 酵母工程菌诱导表达及初步鉴定 | 第53页 |
| 4.1.7 磷标准曲线的制作 | 第53页 |
| 4.1.8 植酸酶酶活的测定及产物鉴定 | 第53-54页 |
| 4.1.9 植酸酶酶学性质的研究 | 第54页 |
| 4.1.10 数据统计与分析 | 第54页 |
| 4.2 结果与分析 | 第54-61页 |
| 4.2.1 植酸酶基因表达片段的PCR扩增 | 第54-55页 |
| 4.2.2 重组质粒pKLAC-phy的鉴定 | 第55-56页 |
| 4.2.3 植酸钙平板初筛阳性酵母工程菌 | 第56-57页 |
| 4.2.4 磷标准曲线的绘制 | 第57页 |
| 4.2.5 表达活性检测及表达量分析 | 第57-59页 |
| 4.2.6 不同因素对酶活的影响 | 第59-61页 |
| 5 讨论与结论 | 第61-64页 |
| 5.1 讨论 | 第61-62页 |
| 5.2 结论 | 第62-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第71页 |
