| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-16页 |
| 1.1 甲状腺过氧化物酶 | 第10-11页 |
| 1.1.1 自身免疫疾病 | 第10页 |
| 1.1.2 甲状腺过氧化物酶概述 | 第10页 |
| 1.1.3 TPO的结构与功能 | 第10-11页 |
| 1.1.4 重组人源TPO蛋白表达的研究进展 | 第11页 |
| 1.2 杆状病毒表达载体系统介绍 | 第11-14页 |
| 1.2.1 昆虫细胞-杆状病毒表达系统概述 | 第11-12页 |
| 1.2.2 杆状病毒表达载体系统的发展 | 第12-13页 |
| 1.2.3 昆虫杆状病毒表达载体系统的应用 | 第13-14页 |
| 1.3 昆虫杆状病毒表达系统存在的问题 | 第14-15页 |
| 1.3.1 瞬时表达问题 | 第14页 |
| 1.3.2 蛋白降解问题 | 第14页 |
| 1.3.3 不可溶表达问题 | 第14页 |
| 1.3.4 分泌表达问题 | 第14-15页 |
| 1.4 课题的研究内容及意义 | 第15-16页 |
| 第2章 hTPOt的表达系统构建及表达测试 | 第16-30页 |
| 2.1 实验材料 | 第16-18页 |
| 2.2 实验方法 | 第18-25页 |
| 2.2.1 菌种保藏及细胞的培养和冻存 | 第18页 |
| 2.2.2 pFastBac1-hTPOt质粒的构建 | 第18-20页 |
| 2.2.3 重组杆状病毒Bacmid的构建 | 第20-21页 |
| 2.2.4 Bacmid-hTPOt质粒转染Sf9细胞获得病毒 | 第21-23页 |
| 2.2.5 重组蛋白在High5细胞中表达的MOI及收获时间优化 | 第23页 |
| 2.2.6 抽提hTPOt胞内蛋白 | 第23-25页 |
| 2.3 实验结果 | 第25-29页 |
| 2.3.1 pFastBac1-hTPOt-His穿梭质粒的构建 | 第25-26页 |
| 2.3.2 Bacmid-hTPOt杆状病毒表达质粒构建 | 第26-27页 |
| 2.3.3 收获高滴度的杆状病毒 | 第27页 |
| 2.3.4 hTPOt在High5细胞中表达条件优化 | 第27-28页 |
| 2.3.5 重组hTPOt细胞的抽提条件优化 | 第28-29页 |
| 2.4 讨论 | 第29页 |
| 2.5 小结 | 第29-30页 |
| 第3章 基于分泌信号肽建立hTPOt分泌表达体系 | 第30-36页 |
| 3.1 实验材料 | 第30页 |
| 3.2 实验方法 | 第30-32页 |
| 3.2.1 配置Sf-900 Ⅱ SFM培养基(1L) | 第30页 |
| 3.2.2 pFastBac1-SPs-hTPOt质粒的构建 | 第30-32页 |
| 3.2.3 重组杆状病毒Bacmid的构建及侵染 | 第32页 |
| 3.2.4 五种重组蛋白在High5细胞中的表达 | 第32页 |
| 3.3 实验结果 | 第32-34页 |
| 3.3.1 分泌信号肽的选择 | 第32-33页 |
| 3.3.2 蛋白分泌效果评价 | 第33-34页 |
| 3.4 讨论 | 第34-35页 |
| 3.5 小结 | 第35-36页 |
| 第4章 p-hTPOt分泌表达体系的放大与优化 | 第36-42页 |
| 4.1 实验材料 | 第36页 |
| 4.2 实验方法 | 第36-38页 |
| 4.2.1 High5细胞培养基配制(1 L) | 第36页 |
| 4.2.2 High 5细胞的培养及冻存: | 第36页 |
| 4.2.3 p-hTPOt在Wave-like反应器中优化表达 | 第36-38页 |
| 4.3 实验结果 | 第38-40页 |
| 4.3.1 接种病毒后High5细胞的密度及存活率变化 | 第38-39页 |
| 4.3.2 Wave-like反应器生产蛋白 | 第39-40页 |
| 4.4 讨论 | 第40-41页 |
| 4.5 小结 | 第41-42页 |
| 第5章 p-hTPOt的蛋白纯化 | 第42-55页 |
| 5.1 实验材料 | 第42页 |
| 5.2 实验方法 | 第42-50页 |
| 5.2.1 试剂配制 | 第42-43页 |
| 5.2.2 浓缩超滤 | 第43-44页 |
| 5.2.3 Ni柱和离子柱的在位清洗及重生 | 第44页 |
| 5.2.4 固定化金属离子亲和层析 | 第44-46页 |
| 5.2.5 离子交换层析 | 第46-47页 |
| 5.2.6 分子筛 | 第47-48页 |
| 5.2.7 蛋白检测方法 | 第48-50页 |
| 5.3 实验结果 | 第50-54页 |
| 5.3.1 亲和纯化High 5细胞表达的p-hTPOt蛋白培养基上清 | 第50-51页 |
| 5.3.2 离子交换纯化p-hTPOt蛋白 | 第51页 |
| 5.3.3 排阻色谱法分析-分子筛 | 第51-53页 |
| 5.3.4 Wave-like反应器和传统摇瓶生产蛋白产量的比较 | 第53-54页 |
| 5.4 讨论 | 第54页 |
| 5.5 小结 | 第54-55页 |
| 第6章 p-hTPOt蛋白的免疫学检测 | 第55-59页 |
| 6.1 实验材料 | 第55页 |
| 6.2 实验方法 | 第55-57页 |
| 6.2.1 酶联免疫吸附测定(ELISA) | 第55页 |
| 6.2.2 Western blot实验步骤 | 第55-56页 |
| 6.2.3 ELISA实验步骤 | 第56-57页 |
| 6.3 实验结果 | 第57-58页 |
| 6.3.1 Western blot实验结果 | 第57页 |
| 6.3.2 ELISA实验结果 | 第57-58页 |
| 6.4 讨论 | 第58页 |
| 6.5 小结 | 第58-59页 |
| 第7章 总结和展望 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 附录 英文缩略词 | 第65-66页 |
| 攻读硕士期间研究论文 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
