| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 符号与縮略语说明 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-31页 |
| 1.1 农杆菌生物学特征 | 第12-18页 |
| 1.1.1 农杆菌简介 | 第12页 |
| 1.1.2 根癌农杆菌的Ti质粒 | 第12-16页 |
| 1.1.2.1 Vir区 | 第13-14页 |
| 1.1.2.2 T-DNA区 | 第14页 |
| 1.1.2.3 T-DNA的转移与整合 | 第14-16页 |
| 1.1.3 Ⅳ型分泌系统 | 第16-17页 |
| 1.1.4 农杆菌T-复合物招募蛋白及其生物学功能 | 第17-18页 |
| 1.2 农杆菌介导法概述 | 第18-19页 |
| 1.2.1 农杆菌介导法的转化机理 | 第18页 |
| 1.2.2 农杆菌介导法的优点 | 第18-19页 |
| 1.2.3 土壤农杆菌介导法在转基因上存在的问题 | 第19页 |
| 1.2.4 农杆菌介导法的研究现状 | 第19页 |
| 1.3 原核生物基因的表达调控 | 第19-25页 |
| 1.3.1 原核生物基因表达调控的方式 | 第19-20页 |
| 1.3.2 原核生物启动子 | 第20-23页 |
| 1.3.2.1 原核生物启动子的分类 | 第20-21页 |
| 1.3.2.2 原核生物启动子的特点 | 第21页 |
| 1.3.2.3 原核生物启动子的研究与应用进展 | 第21-22页 |
| 1.3.2.4 启动子活性分析的研究方法 | 第22-23页 |
| 1.3.3 原核生物转录因子 | 第23-24页 |
| 1.3.4 原核生物操纵子 | 第24页 |
| 1.3.5 CAP的正性调控 | 第24-25页 |
| 1.4 报告基因的选择及应用 | 第25-28页 |
| 1.4.1 绿色荧光蛋白基因概述及其应用 | 第25-27页 |
| 1.4.2 红色荧光蛋白基因概述及其应用 | 第27页 |
| 1.4.3 荧光蛋白标记菌株的检测方法 | 第27-28页 |
| 1.5 研究内容、目的与意义 | 第28-31页 |
| 1.5.1 研究内容 | 第28页 |
| 1.5.2 研究目的与意义 | 第28-31页 |
| 第二章 材料与方法 | 第31-50页 |
| 2.1 引言 | 第31页 |
| 2.2 实验材料 | 第31-36页 |
| 2.2.1 本研究所用菌株 | 第31-32页 |
| 2.2.2 本研究所用质粒 | 第32页 |
| 2.2.3 本研究所用引物 | 第32-34页 |
| 2.2.4 培养基配方与试剂 | 第34-36页 |
| 2.2.4.1 培养基配方 | 第34-35页 |
| 2.2.4.2 试剂 | 第35-36页 |
| 2.2.5 工具酶和试剂盒 | 第36页 |
| 2.2.6 主要实验仪器 | 第36页 |
| 2.3 实验方法 | 第36-50页 |
| 2.3.1 Atu4860启动子区转录因子结合位点的生物信息学预测分析 | 第36页 |
| 2.3.2 构建pRSET-AGFP2重组表达质粒 | 第36-41页 |
| 2.3.2.1 PCR扩增带有gfp基因的Atu4860启动子序列 | 第36-38页 |
| 2.3.2.2 提取大肠杆菌pRSET-A质粒 | 第38-39页 |
| 2.3.2.3 PCR扩增得到不含T7启动子的pRSET-A质粒 | 第39页 |
| 2.3.2.4 DNA的酶切、连接、转化以及重组子的筛选 | 第39-41页 |
| 2.3.3 启动子核心区的确定与活性检测 | 第41-43页 |
| 2.3.3.1 Atu4860上游不同长度启动子序列的克隆及重组表达质粒的构建 | 第41-42页 |
| 2.3.3.2 缺失突变体发光特性及荧光强度的检测分析 | 第42页 |
| 2.3.3.3 重组菌E.coli(pRSET-AGFP2S)生长曲线的绘制 | 第42-43页 |
| 2.3.4 组成型表达的红色荧光蛋白基因的插入 | 第43-44页 |
| 2.3.5 不同诱导条件对E.coli(pRSE-AGFP2S)中Atu4860启动子活性的影响 | 第44页 |
| 2.3.5.1 培养基对E.coli(pRSET-AGFP2S)中Atu4860启动子活性的影响 | 第44页 |
| 2.3.5.2 温度对E.coli(pRSET-AGFP2S)中Atu4860启动子活性的影响 | 第44页 |
| 2.3.5.3 pH对E.coli (pRSET-AGFP2S)中Atu4860启动子活性的影响 | 第44页 |
| 2.3.6 Atu4860调控序列中突变位点的设计 | 第44-48页 |
| 2.3.6.1 fadR结合位点的突变 | 第45-46页 |
| 2.3.6.2 rhaS结合位点的突变 | 第46-47页 |
| 2.3.6.3 CAP/CRP结合位点的突变 | 第47-48页 |
| 2.3.7 点突变体中荧光蛋白的表达情况及荧光强度的检测分析 | 第48页 |
| 2.3.8 Atu4860调控序列中可能存在的转录因子结合位点的验证 | 第48-50页 |
| 2.3.8.1 含油酸培养基中E.coli(pRSET-AGFP2SfadR)荧光蛋白的定量研究 | 第48-49页 |
| 2.3.8.2 含鼠李糖培养基中E.coli(pRSET-AGFP2SrhaS)荧光蛋白的定量研究 | 第49页 |
| 2.3.8.3 含IPTG培养基中E.coli(pRSET-AGFP2SCAP)荧光蛋白的定量研究 | 第49-50页 |
| 第三章 实验结果 | 第50-68页 |
| 3.1 Atu4860启动子转录因子结合位点的生物信息学预测分析结果 | 第50-51页 |
| 3.2 pRSET-AGFP2重组表达质粒的构建 | 第51-55页 |
| 3.2.1 PCR扩增带有加基因的Atu4860启动子序列 | 第52-53页 |
| 3.2.2 PCR扩增得到不含T7启动子的pRSET-A质粒 | 第53-54页 |
| 3.2.3 pRSET-GFP2重组质粒的酶切鉴定 | 第54页 |
| 3.2.4 验证Atu4860启动子在探针载体中的活性 | 第54-55页 |
| 3.3 Atu4860基因启动子核心区的鉴定 | 第55-58页 |
| 3.3.1 携带不同长度Atu4860基因上游片段的重组质粒的构建 | 第55-56页 |
| 3.3.2 Atu4860基因上游不同长度序列片段的转录活性分析 | 第56-58页 |
| 3.3.3 重组菌E.coli(pRSET-AGFP2S)生长曲线的绘制 | 第58页 |
| 3.4 组成型表达的红色荧光蛋白基因的插入 | 第58-59页 |
| 3.5 诱导条件对E.coli(pRSET-AGFP2S)中Atu4860启动子活性的影响 | 第59-61页 |
| 3.5.1 培养基对E.coli(pRSET-AGFP2S)中Atu4860启动子活性的影响 | 第59-60页 |
| 3.5.2 温度对E.coli(pRSET-AGFP2S)中Atu4860启动子活性的影响 | 第60-61页 |
| 3.5.3 pH对E.coli(pRSET-AGFP2S)中Atu4860启动子活性的影响 | 第61页 |
| 3.6 Atu4860调控序列突变体的构建 | 第61-65页 |
| 3.6.1 fadR结合位点突变体的构建 | 第61-62页 |
| 3.6.2 rhaS结合位点突变体的构建 | 第62-64页 |
| 3.6.3 CAP/CRP结合位点突变体的构建 | 第64-65页 |
| 3.7 三种突变体中荧光蛋白的表达情况及荧光强度的定量分析 | 第65页 |
| 3.8 Atu4860调控序列中可能存在的转录因子结合位点的验证 | 第65-68页 |
| 3.8.1 含油酸培养基中E.coli(pRSET-AGFP2SfadR)荧光蛋白的定量研究 | 第65-66页 |
| 3.8.2 含鼠李糖培养基中E.coli(pRSET-AGFP2SrhaS)荧光蛋白的定量研究 | 第66-67页 |
| 3.8.3 含IPTG培养基中E.coli(pRSET-AGFP2SCAP)荧光蛋白的定量研究 | 第67-68页 |
| 第四章 讨论 | 第68-71页 |
| 结语与展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第77-78页 |
