| 符号说明 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第12-23页 |
| 1.1 酚酸类物质参与化感自毒的研究现状 | 第12-18页 |
| 1.1.1 酚酸类物质的产生及释放途径 | 第12-13页 |
| 1.1.2 酚酸类物质化感自毒作用机制 | 第13-15页 |
| 1.1.2.1 酚酸类物质间的相互作用 | 第13-14页 |
| 1.1.2.2 酚酸类物质影响植物的生理功能 | 第14-15页 |
| 1.1.3 微生物降解酚酸类物质的机理 | 第15-17页 |
| 1.1.4 苹果主要的化感自毒物质根皮苷 | 第17-18页 |
| 1.2 β-葡萄糖苷酶研究现状 | 第18-21页 |
| 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的分类 | 第18-19页 |
| 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的理化性质 | 第19页 |
| 1.2.3 β-葡萄糖苷酶的作用机制 | 第19页 |
| 1.2.4 β-葡萄糖苷酶的酶活测定方法 | 第19-20页 |
| 1.2.5 黄酮糖苷β-葡萄糖苷酶的研究现状 | 第20-21页 |
| 1.3 微生物中克隆基因的研究方法 | 第21-22页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-45页 |
| 2.1 供试材料 | 第23-29页 |
| 2.1.1 供试菌种与载体 | 第23页 |
| 2.1.2 培养基 | 第23页 |
| 2.1.3 酶及生化药品 | 第23-24页 |
| 2.1.4 试剂配方及配制方法 | 第24-27页 |
| 2.1.5 实验仪器设备 | 第27-28页 |
| 2.1.6 实验设计引物 | 第28-29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-45页 |
| 2.2.1 AMCC100102降解根皮苷的降解通路推测 | 第29-30页 |
| 2.2.1.1 高效液相法检测根皮苷降解产物 | 第29-30页 |
| 2.2.1.2 食树脂新鞘氨醇菌降解根皮苷的降解通路推测 | 第30页 |
| 2.2.2 转座子插入法筛选根皮苷降解缺陷株 | 第30-32页 |
| 2.2.2.1 AMCC100102抗生素谱的测定 | 第30页 |
| 2.2.2.2 AMCC100102对培养基凝固剂碳源利用的测定 | 第30-31页 |
| 2.2.2.3 三亲本接合筛选插入子 | 第31页 |
| 2.2.2.4 插入子中转座子序列的验证 | 第31-32页 |
| 2.2.2.5 根皮苷降解缺陷株的筛选 | 第32页 |
| 2.2.3 AMCC100102基因组框架图测序 | 第32-34页 |
| 2.2.3.1 CTAB法提取细菌基因组DNA | 第32-33页 |
| 2.2.3.2 基因组框架图测序 | 第33-34页 |
| 2.2.3.3 候选β-葡萄糖苷酶基因分析 | 第34页 |
| 2.2.4 利用不同碳源培养寻找表达差异的基因 | 第34-37页 |
| 2.2.4.1 AMCC100102分别以葡萄糖和根皮苷为唯一碳源培养 | 第34-35页 |
| 2.2.4.2 AMCC100102总RNA的提取 | 第35页 |
| 2.2.4.3 AMCC100102总cDNA的合成 | 第35页 |
| 2.2.4.4 RT-PCR检测候选基因利用不同碳源培养的表达差异 | 第35-37页 |
| 2.2.5 bdg5和bdg6克隆载体及表达载体构建 | 第37-41页 |
| 2.2.5.1 DNA目的片段的扩增 | 第37-38页 |
| 2.2.5.2 DNA目的片段平末端加腺苷酸反应 | 第38页 |
| 2.2.5.3 DNA目的片段与载体连接 | 第38页 |
| 2.2.5.4 酶切反应 | 第38-39页 |
| 2.2.5.5 大肠杆菌中质粒的提取 | 第39页 |
| 2.2.5.6 大肠杆菌TOP10感受态的制备 | 第39-40页 |
| 2.2.5.7 大肠杆菌Rosetta感受态的制备 | 第40页 |
| 2.2.5.8 大肠杆菌细胞的转化 | 第40-41页 |
| 2.2.6 目的基因编码蛋白序列的生物信息学分析 | 第41页 |
| 2.2.7 目的基因的原核诱导及表达 | 第41-45页 |
| 2.2.7.1 诱导的最佳IPTG浓度选择 | 第41-42页 |
| 2.2.7.2 诱导的最佳温度选择 | 第42页 |
| 2.2.7.3 SDS-PAGE检测表达产物 | 第42-43页 |
| 2.2.7.4 融合蛋白的His标签镍柱纯化 | 第43页 |
| 2.2.7.5 薄层色谱法检测酶的作用产物 | 第43-45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-70页 |
| 3.1 AMCC100102降解根皮苷产物测定及降解通路推测 | 第45-48页 |
| 3.1.1 降解产物的高效液相法定性 | 第45-48页 |
| 3.2 转座子插入法筛选根皮苷降解缺陷株 | 第48-51页 |
| 3.2.1 AMCC100102抗生素谱的测定 | 第48-49页 |
| 3.2.2 AMCC100102对培养基凝固剂碳源利用的测定 | 第49页 |
| 3.2.3 三亲本接合筛选插入子及插入子中转座子序列的验证 | 第49-51页 |
| 3.3 AMCC100102基因组框架图测序 | 第51-54页 |
| 3.3.1 AMCC100102基因组DNA提取及检测结果 | 第51-52页 |
| 3.3.2 基因组框架图结题报告及β-葡萄糖苷酶基因分析 | 第52-54页 |
| 3.4 利用不同碳源寻找差异表达的β-葡萄糖苷酶基因 | 第54-56页 |
| 3.4.1 RT-PCR引物特异性检测结果 | 第54-55页 |
| 3.4.2 RT-PCR检测候选基因的表达差异结果 | 第55-56页 |
| 3.5 bdg5和bdg6基因克隆、表达载体构建及生物信息学分析 | 第56-62页 |
| 3.5.1 基因片段的扩增结果 | 第56页 |
| 3.5.2 基因片段连接克隆及序列测序 | 第56-58页 |
| 3.5.3 表达载体构建 | 第58-59页 |
| 3.5.4 生物信息学分析 | 第59-62页 |
| 3.5.4.1 BDG5和BDG6的物理性质预测 | 第59页 |
| 3.5.4.2 BDG5和BDG6的二级结构和保守结构域分析 | 第59-60页 |
| 3.5.4.3 BDG5和BDG6的三级结构分析 | 第60页 |
| 3.5.4.4 BDG5和BDG6的信号肽、跨膜结构和疏水性分析 | 第60-62页 |
| 3.6 bdg5和bdg6的原核诱导及表达 | 第62-70页 |
| 3.6.1 原核诱导菌种的选择 | 第62页 |
| 3.6.2 最佳诱导表达条件 | 第62-65页 |
| 3.6.3 融合蛋白的纯化结果 | 第65-67页 |
| 3.6.4 融合蛋白的活性检测 | 第67-70页 |
| 4 讨论 | 第70-72页 |
| 5 结论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
