| 中文摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 部分缩写及符号说明 | 第8-14页 |
| 1 文献综述 | 第14-19页 |
| 1.1 DHAV-1概述 | 第14页 |
| 1.2 DHAV-1的分子生物学 | 第14-15页 |
| 1.3 小RNA病毒的RdRP | 第15页 |
| 1.4 单股正链RNA病毒的3'UTR | 第15-19页 |
| 1.4.1 一级结构与功能 | 第15-17页 |
| 1.4.1.1 环化序列 | 第15-16页 |
| 1.4.1.2 其他具有重要功能的特异序列 | 第16-17页 |
| 1.4.2 高级结构与功能 | 第17-19页 |
| 1.4.2.1 茎环结构 | 第17-18页 |
| 1.4.2.2 假结结构 | 第18-19页 |
| 2 研究目的与意义 | 第19页 |
| 3 材料与方法 | 第19-37页 |
| 3.1 实验材料 | 第19-23页 |
| 3.1.1 病毒、菌株、载体及鸭胚 | 第19页 |
| 3.1.2 PCR引物 | 第19-20页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第20-21页 |
| 3.1.4 试剂与缓冲液的配制 | 第21-22页 |
| 3.1.4.1 细菌培养基 | 第21页 |
| 3.1.4.2 琼脂糖凝胶电泳所需试剂 | 第21-22页 |
| 3.1.4.3 SDS-PAGE与Western-blot所需试剂 | 第22页 |
| 3.1.5 实验仪器设备 | 第22页 |
| 3.1.6 实验分析软件 | 第22-23页 |
| 3.2 实验方法 | 第23-37页 |
| 3.2.1 DHAV-1 3'UTR的生物信息学分析 | 第23-24页 |
| 3.2.1.1 DHAV 3'UTR的核苷酸序列分析 | 第23页 |
| 3.2.1.2 DHAV-1 3'UTR的高级结构预测 | 第23-24页 |
| 3.2.1.3 DHAV-1 3D蛋白与3'UTR的相互作用预测 | 第24页 |
| 3.2.2 DHAV-1 3D蛋白及3'UTR RNA的制备 | 第24-28页 |
| 3.2.2.1 DHAV-1 3D蛋白样品的制备 | 第24-25页 |
| 3.2.2.2 DHAV-1 3'UTR T克隆的构建 | 第25-27页 |
| 3.2.2.3 DHAV-1 3'UTR的体外转录、纯化及鉴定 | 第27-28页 |
| 3.2.3 DHAV-1 3D蛋白RdRP活性鉴定 | 第28-30页 |
| 3.2.3.1 钼酸铵分光光度法检测3D酶促反应生成的焦磷酸 | 第28-29页 |
| 3.2.3.2 荧光定量RT-PCR检测3D酶促反应生成的RNA | 第29-30页 |
| 3.2.4 EMSA检测3D蛋白与3'UTR的结合能力 | 第30-33页 |
| 3.2.4.1 对3'UTR RNA标记生物素 | 第30-31页 |
| 3.2.4.2 EMSA实验 | 第31-33页 |
| 3.2.5 DHAV-1 3D蛋白在3'UTR上的结合位点鉴定 | 第33-34页 |
| 3.2.5.1 DHAV-1 3'UTR各片段T克隆的构建 | 第33-34页 |
| 3.2.5.2 DHAV-1 3'UTR各片段的体外转录、纯化及鉴定 | 第34页 |
| 3.2.5.3 EMSA检测3D蛋白在3'UTR上的结合位点 | 第34页 |
| 3.2.6 3D蛋白在3'UTR上的结合位点对DHAV-1增殖的作用鉴定 | 第34-37页 |
| 3.2.6.1 靶向3D蛋白在3'UTR上结合位点的siRNA的设计 | 第34-35页 |
| 3.2.6.2 鸭胚成纤维细胞的制备 | 第35页 |
| 3.2.6.3 转染与接毒 | 第35页 |
| 3.2.6.4 定量PCR检测siRNA对DHAV-1复制的影响 | 第35-36页 |
| 3.2.6.5 Western-blot检测siRNA对DHAV-1翻译的影响 | 第36-37页 |
| 4 实验结果 | 第37-52页 |
| 4.1 DHAV-1 3'UTR的生物信息学分析 | 第37-40页 |
| 4.1.1 DHAV 3'UTR的核苷酸序列分析 | 第37-38页 |
| 4.1.2 DHAV-1 3'UTR的高级结构预测 | 第38页 |
| 4.1.3 DHAV-1 3D蛋白与3'UTR的相互作用预测 | 第38-40页 |
| 4.2 DHAV-1 3D蛋白与3'UTR RNA的制备 | 第40-43页 |
| 4.2.1 DHAV-1 3D蛋白样品的制备 | 第40-41页 |
| 4.2.2 DHAV-1 3'UTR RNA样品的制备 | 第41-43页 |
| 4.3 DHAV-1 3D蛋白RdRP活性鉴定 | 第43-45页 |
| 4.3.1 钼酸铵分光光度法检测3D酶促反应生成的焦磷酸 | 第43-44页 |
| 4.3.1.1 标准曲线的绘制 | 第43页 |
| 4.3.1.2 检测3D蛋白RdRP活性 | 第43-44页 |
| 4.3.2 荧光定量RT-PCR检测3D酶促反应生成的RNA | 第44-45页 |
| 4.3.2.1 标准曲线的绘制 | 第44-45页 |
| 4.3.2.2 检测3D蛋白RdRP活性 | 第45页 |
| 4.4 DHAV-1 3D蛋白与3'UTR结合能力的鉴定 | 第45-46页 |
| 4.5 DHAV-1 3D蛋白在3'UTR上的结合位点鉴定 | 第46-48页 |
| 4.5.1 3'UTR各片段RNA样品的制备 | 第46-47页 |
| 4.5.1.1 3'UTR各片段T克隆的构建 | 第46页 |
| 4.5.1.2 3,UTR各片段的体外转录 | 第46-47页 |
| 4.5.2 EMSA检测3D蛋白在3'UTR上的结合位点 | 第47-48页 |
| 4.6 3D蛋白在3'UTR上的结合位点对DHAV-1增殖的作用鉴定 | 第48-52页 |
| 4.6.1 靶向3D蛋白在3'UTR上结合位点的siRNA的设计 | 第48-50页 |
| 4.6.2 siRNA的转染与观察 | 第50-51页 |
| 4.6.3 siRNA对DHAV-1复制的影响 | 第51页 |
| 4.6.4 siRNA对DHAV-1翻译的影响 | 第51-52页 |
| 5 分析及讨论 | 第52-58页 |
| 5.1 DHAV-1 3'UTR的生物信息学分析 | 第52-53页 |
| 5.2 DHAV-1 3D蛋白RdRP活性鉴定 | 第53-55页 |
| 5.3 DHAV-1 3D蛋白在3'UTR上的结合位点鉴定 | 第55-56页 |
| 5.4 siRNA干扰3D蛋白在3'UTR上的结合位点对DHAV-1增殖的影响 | 第56-58页 |
| 6 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第68页 |
