| 摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩写语表(Abbreviations) | 第11-18页 |
| 前言 | 第18-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-30页 |
| 第一节 木聚糖的结构与性质 | 第20-22页 |
| 1. 木聚糖的结构 | 第20-21页 |
| 2. 木聚糖的性质 | 第21-22页 |
| 2.1 粘性 | 第21页 |
| 2.2 吸附能力 | 第21页 |
| 2.3 抗营养特性 | 第21-22页 |
| 第二节 木聚糖的降解酶系统 | 第22-26页 |
| 1. 木聚糖的降解途径及其关键酶 | 第22-23页 |
| 2. 木聚糖酶的分类 | 第23-24页 |
| 3. 木聚糖酶的工业应用 | 第24-26页 |
| 3.1 造纸工业 | 第24页 |
| 3.2 食品工业 | 第24-25页 |
| 3.3 饲料工业 | 第25-26页 |
| 第三节 耐热木聚糖酶研究意义与进展 | 第26-30页 |
| 1. 耐热木聚糖酶研究的意义 | 第26页 |
| 2. 耐热木聚糖酶研究进展 | 第26-30页 |
| 2.1 耐热木聚糖酶来源 | 第26-27页 |
| 2.2 耐热木聚糖酶的异源表达 | 第27-28页 |
| 2.3 蛋白质工程耐热改造方法 | 第28-30页 |
| 第二章 本研究的目的、内容、意义与技术路线 | 第30-32页 |
| 1. 研究目的 | 第30页 |
| 2. 研究内容 | 第30页 |
| 3. 研究意义 | 第30-31页 |
| 4. 本研究技术路线 | 第31-32页 |
| 第三章 实验研究 | 第32-90页 |
| 第一节 里氏木霉Xyn2克隆、序列分析及突变基因的设计 | 第32-51页 |
| 1. 克隆策略及突变基因设计 | 第32页 |
| 2. 实验材料 | 第32-35页 |
| 3. 实验方法 | 第35-43页 |
| 3.1 里氏木霉木聚糖酶基因Xyn2克隆 | 第35-41页 |
| 3.1.1 里氏木霉Rut C-30(Trichoderma reesi Rut C-30)活化 | 第35页 |
| 3.1.2 里氏木霉Xyn2诱导表达 | 第35页 |
| 3.1.3 总RNA提取 | 第35-36页 |
| 3.1.4 cDNA合成 | 第36-37页 |
| 3.1.5 里氏木霉Xyn2克隆 | 第37-38页 |
| 3.1.6 PCR产物电泳鉴定 | 第38页 |
| 3.1.7 pMD19-T(simple)载体连接(TA克隆法) | 第38页 |
| 3.1.8 重组质粒T-Xyn2转化与筛选 | 第38-40页 |
| 3.1.9 T.ressei Xyn2序列分析 | 第40-41页 |
| 3.2 Xyn2突变基因构建 | 第41-43页 |
| 3.2.1 突变策略 | 第41页 |
| 3.2.2 突变PCR | 第41-42页 |
| 3.2.3 突变PCR产物电泳鉴定 | 第42页 |
| 3.2.4 去除模板质粒 | 第42页 |
| 3.2.5 突变质粒转化 | 第42页 |
| 3.2.6 重组大肠杆菌筛选 | 第42-43页 |
| 4 实验结果 | 第43-49页 |
| 4.1 里氏木霉Xyn2基因克隆 | 第43-46页 |
| 4.1.1 总RNA提取 | 第43页 |
| 4.1.2 Xyn2扩增PCR产物鉴定 | 第43-44页 |
| 4.1.3 菌落PCR鉴定 | 第44页 |
| 4.1.4 DNA测序结果 | 第44-45页 |
| 4.1.5 蛋白质三维结构建模及分析 | 第45-46页 |
| 4.2 Xyn2突变基因构建 | 第46-49页 |
| 4.2.1 突变PCR鉴定 | 第46-47页 |
| 4.2.2 突变Xyn2基因重组大肠杆菌筛选 | 第47-48页 |
| 4.2.3 DNA测序及比对 | 第48页 |
| 4.2.4 氨基酸序列比对 | 第48-49页 |
| 5 讨论 | 第49-51页 |
| 第二节 Xyn2在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析 | 第51-69页 |
| 1. 表达及纯化策略 | 第51页 |
| 2. 实验材料 | 第51-54页 |
| 3. 实验方法 | 第54-59页 |
| 3.1 表达载体构建 | 第54-55页 |
| 3.1.1 双酶切 | 第54页 |
| 3.1.2 酶切片段回收 | 第54页 |
| 3.1.3 XynⅡ基因及其突变体与表达载体pET32a(+)连接 | 第54-55页 |
| 3.1.4 转化筛选 | 第55页 |
| 3.1.5 测序 | 第55页 |
| 3.2 原核表达 | 第55-56页 |
| 3.2.1 表达菌株构建 | 第55页 |
| 3.2.2 诱导表达 | 第55-56页 |
| 3.2.3 可溶蛋白收集 | 第56页 |
| 3.2.4 Xyn2及其突变体SDS-PAGE鉴定 | 第56页 |
| 3.2.5 Xyn2突变体质谱检测 | 第56页 |
| 3.2.6 Xyn2突变体二硫键检测 | 第56页 |
| 3.3 蛋白质定量 | 第56-57页 |
| 3.4 酶学性质分析 | 第57-59页 |
| 3.4.1 标准酶活力测定体系 | 第57-58页 |
| 3.4.2 最适酶促反应温度 | 第58页 |
| 3.4.3 最适酶促反应pH | 第58页 |
| 3.4.4 热稳定性 | 第58页 |
| 3.4.5 pH稳定性 | 第58页 |
| 3.4.6 酶促动力学参数 | 第58-59页 |
| 3.4.7 二硫键对热稳定性的影响 | 第59页 |
| 4. 实验结果 | 第59-64页 |
| 4.1 木聚糖酶Xyn2及其突变体SDS-PAGE鉴定 | 第59页 |
| 4.2 木聚糖酶Xyn2突变体质谱鉴定 | 第59-61页 |
| 4.3 二硫键检测 | 第61-62页 |
| 4.4 pH对酶活力的影响 | 第62页 |
| 4.5 温度对酶活力的影响 | 第62-63页 |
| 4.6 酶的热衰减 | 第63页 |
| 4.7 二硫键对没热稳定性的影响 | 第63-64页 |
| 4.8 酶促动力学参数 | 第64页 |
| 5. 讨论 | 第64-69页 |
| 第三节、Xyn2在毕赤酵母中的表达及酶学性质分析 | 第69-80页 |
| 1. 表达及纯化策略 | 第69页 |
| 2. 实验材料 | 第69-72页 |
| 3. 实验方法 | 第72-75页 |
| 3.1 重组pPICZαA载体构建 | 第72页 |
| 3.2 重组pPICZαA载体线性化及浓缩 | 第72-73页 |
| 3.3 重组毕赤酵母构建 | 第73页 |
| 3.3.1 P.pastoris x-33感受态制备 | 第73页 |
| 3.3.2 电击转化与筛选 | 第73页 |
| 3.3.3 基组PCR鉴定 | 第73页 |
| 3.4 毕酵母诱导表达 | 第73-74页 |
| 3.4.1 平活化 | 第73页 |
| 3.4.2 一种子制备 | 第73-74页 |
| 3.4.3 扩培养 | 第74页 |
| 3.4.4 诱培养 | 第74页 |
| 3.4.5 粗液收集 | 第74页 |
| 3.5 分泌蛋白及其糖基化分析 | 第74页 |
| 3.5.1 Xyn2及其突变体糖基化位点预测 | 第74页 |
| 3.5.2 分泌蛋白及其糖基化SDS-PAGE鉴定 | 第74页 |
| 3.6 蛋白定量 | 第74页 |
| 3.7 酶学性质分析 | 第74-75页 |
| 3.7.1 酶活力测定 | 第74页 |
| 3.7.2 动力学参数测定 | 第74页 |
| 3.7.3 最适温度分析 | 第74-75页 |
| 3.7.4 最适pH分析 | 第75页 |
| 3.7.5 热稳定性分析 | 第75页 |
| 3.7.6 pH稳定性分析 | 第75页 |
| 3.7.7 糖基化对热稳定性的影响 | 第75页 |
| 4 实验结果 | 第75-78页 |
| 4.1 糖基化预测及检测 | 第75-76页 |
| 4.2 糖基化对热稳定性的影响 | 第76页 |
| 4.3 酶活力及动力学参数 | 第76-77页 |
| 4.4 pH对酶活力的影响及pH稳定性 | 第77页 |
| 4.5 温度对酶活力的影响及热稳定性 | 第77-78页 |
| 5 讨论 | 第78-80页 |
| 第四节 、耐热木聚糖酶表达条件优化及其稳定性研究 | 第80-90页 |
| 1. 表达条件优化及稳定性评估策略 | 第80页 |
| 2. 实验材料 | 第80-81页 |
| 3. 实验方法 | 第81-82页 |
| 3.1 表达条件优化 | 第81-82页 |
| 3.1.1 响应面实验设计 | 第81-82页 |
| 3.1.2 诱导表达 | 第82页 |
| 3.1.3 粗酶液收集及酶活力测定 | 第82页 |
| 3.1.4 数据分析 | 第82页 |
| 3.2 木聚糖酶肠道稳定性评定 | 第82页 |
| 3.2.1 实验设计 | 第82页 |
| 3.2.2 饲养管理 | 第82页 |
| 3.2.3 样品采集 | 第82页 |
| 3.2.4 食糜木聚糖酶残余酶活测定 | 第82页 |
| 4 实验结果 | 第82-88页 |
| 4.1 表达条件优化 | 第82-88页 |
| 4.1.1 各表达条件酶活力 | 第82-83页 |
| 4.1.2 响应面模型分析 | 第83-84页 |
| 4.1.3 单因素分析 | 第84-85页 |
| 4.1.4 双因素交互性分析 | 第85-86页 |
| 4.1.5 最优实验组合 | 第86-88页 |
| 4.2 耐热木聚糖酶稳定性评估 | 第88页 |
| 5 讨论 | 第88-90页 |
| 第四章 全文总结、创新点和今后研究展望 | 第90-93页 |
| 一、全文总结 | 第90-91页 |
| 二、本文主要创新点 | 第91页 |
| 三、今后需进一步研究的问题 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 攻读硕士期间发表文章 | 第99页 |
