| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第10-23页 |
| 1.1 β-葡萄糖苷酶概论 | 第10-15页 |
| 1.1.1 β-葡萄糖苷酶简介 | 第10页 |
| 1.1.2 β-葡萄糖苷酶的克隆与表达现状 | 第10-11页 |
| 1.1.3 β-葡萄糖苷酶的结构与催化机制 | 第11-14页 |
| 1.1.4 β-葡萄糖苷酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.2 β-葡萄糖苷酶分子改造研究进展 | 第15-19页 |
| 1.2.1 定点突变 | 第15-16页 |
| 1.2.2 定向进化 | 第16-18页 |
| 1.2.3 半理性设计 | 第18-19页 |
| 1.2.4 小结 | 第19页 |
| 1.3 多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的研究现状 | 第19-20页 |
| 1.4 本文的研究内容与方法 | 第20-22页 |
| 1.4.1 研究内容 | 第20-21页 |
| 1.4.2 技术路线 | 第21-22页 |
| 1.5 本文的创新之处 | 第22-23页 |
| 第二章 PpBBglA在E.coliBL21 (DE3)中的表达及酶学性质研究 | 第23-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第23-24页 |
| 2.1.2 培养基 | 第24页 |
| 2.1.3 生物化学与分子生物学试剂(盒) | 第24页 |
| 2.1.4 主要实验仪器 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-27页 |
| 2.2.1 主要溶液的配制 | 第25-26页 |
| 2.2.2 PpBBglA基因的克隆及序列测定 | 第26页 |
| 2.2.3 IPTG诱导表达的最佳浓度 | 第26页 |
| 2.2.4 PpBBglA的分离纯化及SDS-PAGE分析 | 第26-27页 |
| 2.2.5 β-葡萄糖苷酶酶活力的测定 | 第27页 |
| 2.2.6 PpBBglA的动力学特征 | 第27页 |
| 2.2.7 底物间抑制动力学 | 第27页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第27-36页 |
| 2.3.1 重组β-葡萄糖苷酶的基因和氨基酸序列特征 | 第27-29页 |
| 2.3.2 pNP标准曲线 | 第29页 |
| 2.3.3 IPTG浓度对重组β-葡萄糖苷酶可溶性表达水平的影响 | 第29-30页 |
| 2.3.4 重组β-葡萄糖苷酶的纯化及SDS-PAGE分析 | 第30-31页 |
| 2.3.5 PpBBglA的基本性质 | 第31-33页 |
| 2.3.6 底物结构与PpBBglA催化动力学的关系 | 第33页 |
| 2.3.7 底物间抑制动力学 | 第33-36页 |
| 2.4 本章小结 | 第36-37页 |
| 第三章 密码子优化提高PpBBglA异源表达量 | 第37-53页 |
| 3.1 实验材料 | 第37-38页 |
| 3.1.1 菌种与质粒 | 第37-38页 |
| 3.1.2 培养基及主要实验仪器 | 第38页 |
| 3.1.3 药品与溶液 | 第38页 |
| 3.2 实验方法 | 第38-40页 |
| 3.2.1 PpBBglA基因的定点突变 | 第38-39页 |
| 3.2.2 密码子优化型PpBBglA的表达量分析 | 第39-40页 |
| 3.2.3 表达载体对表达量的影响 | 第40页 |
| 3.2.4 表达宿主对表达量的影响 | 第40页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第40-51页 |
| 3.3.1 PpBBglA的密码子偏性 | 第40-42页 |
| 3.3.2 内参蛋白质β-半乳糖苷酶的表达量稳定性 | 第42-43页 |
| 3.3.3 同义密码子替换对重组酶表达量的影响 | 第43-46页 |
| 3.3.4 表达载体对表达量的影响 | 第46-47页 |
| 3.3.5 表达宿主对表达量的影响 | 第47-48页 |
| 3.3.6 各类重组基因在不同IPTG浓度下的表达量比较 | 第48-49页 |
| 3.3.7 常用密码子偏性衡量指数与实际表达量的关系 | 第49-50页 |
| 3.3.8 ppbbglA基因密码子偏性对表达量影响方式的讨论 | 第50-51页 |
| 3.3.9 怎样选择最值得优化的密码子 | 第51页 |
| 3.3.10 密码子基因型优化方法和宿主修饰方法的比较 | 第51页 |
| 3.4 本章小结 | 第51-53页 |
| 第四章 定向进化提高PpBBglA催化效率 | 第53-62页 |
| 4.1 实验材料 | 第53-54页 |
| 4.1.1 培养基 | 第53页 |
| 4.1.2 药品与溶液 | 第53页 |
| 4.1.3 主要实验仪器 | 第53-54页 |
| 4.2 实验方法 | 第54-55页 |
| 4.2.1 变体库的构建 | 第54页 |
| 4.2.2 平板-微孔板法筛选高水解活性突变体 | 第54-55页 |
| 4.2.3 突变酶的动力学参数测定 | 第55页 |
| 4.2.4 突变体的结构分析 | 第55页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第55-60页 |
| 4.3.1 高催化效率突变体的筛选 | 第55-56页 |
| 4.3.2 高催化效率突变体的序列分析 | 第56页 |
| 4.3.3 突变酶的动力学及耐热性变化 | 第56-57页 |
| 4.3.4 高催化效率突变体的结构分析 | 第57-60页 |
| 4.4 本章小结 | 第60-62页 |
| 第五章 定点突变提高PpBBglA热稳定性 | 第62-71页 |
| 5.1 实验材料 | 第62页 |
| 5.2 实验方法 | 第62-63页 |
| 5.2.1 引物设计 | 第62-63页 |
| 5.2.2 定点突变构建热稳定型突变体 | 第63页 |
| 5.2.3 突变酶的分离纯化及酶学性质研究 | 第63页 |
| 5.2.4 CD光谱 | 第63页 |
| 5.2.5 热稳型PpBBglA的结构分析 | 第63页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第63-70页 |
| 5.3.1 热稳定型突变体的筛选 | 第63-64页 |
| 5.3.2 单突变体的热稳定性分析 | 第64-65页 |
| 5.3.3 组合突变体的动力学参数变化与相对表达量 | 第65-66页 |
| 5.3.4 突变体酶的耐热性比较 | 第66页 |
| 5.3.5 野生酶突变体的CD光谱 | 第66-68页 |
| 5.3.6 突变体的热稳定性与分子间弱相互作用 | 第68-70页 |
| 5.4 本章小结 | 第70-71页 |
| 第六章 PpBBglA的寡聚体分析及活性-寡聚态-温度之间关系的猜想 | 第71-83页 |
| 6.1 实验材料 | 第71-72页 |
| 6.1.1 实验药品 | 第71页 |
| 6.1.2 溶液配制 | 第71-72页 |
| 6.2 方法 | 第72-73页 |
| 6.2.1 PpBBglA的非变性凝胶电泳 | 第72页 |
| 6.2.2 Sephadex G-200凝胶过滤柱分离PpBBglA多聚体 | 第72页 |
| 6.2.3 PpBBglA的还原与非还原SDS-PAGE分析 | 第72页 |
| 6.2.4 温度对PpBBglA多聚体解离的影响 | 第72-73页 |
| 6.2.5 PpBBglA的紫外扫描光谱 | 第73页 |
| 6.2.6 PpBBglA多聚体亚基间相互作用的信息学分析 | 第73页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第73-82页 |
| 6.3.1 PpBBglA的 Native-PAGE | 第73-74页 |
| 6.3.2 葡聚糖凝胶过滤柱分离PpBBglA多聚体 | 第74-76页 |
| 6.3.3 PpBBglA的还原与非还原SDS-PAGE分析 | 第76-77页 |
| 6.3.4 温度对PpBBglA多聚体形式的影响 | 第77-78页 |
| 6.3.5 温度对PpBBglA立体构象的影响 | 第78-79页 |
| 6.3.6 PpBBglA功能二聚体的亚基空间位置推断 | 第79-82页 |
| 6.4 本章小结 | 第82-83页 |
| 主要结论与建议 | 第83-85页 |
| 结论 | 第83-84页 |
| 建议 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 个人简历 | 第95页 |
| 在读期间已发表和录用的论文 | 第95页 |
