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草鱼白细胞介素10的免疫调节功能及其作用机制研究

摘要第5-8页
ABSTRACT第8-11页
第一章 绪论第17-26页
    1.1 哺乳动物IL-10及其受体和下游细胞信号通路第17-20页
        1.1.1 IL-10的分子结构第17-18页
        1.1.2 IL-10的分泌细胞第18页
        1.1.3 IL-10的I型受体第18页
        1.1.4 IL-10的II型受体第18-19页
        1.1.5 IL-10介导的JAK/STAT信号通路第19-20页
    1.2 哺乳动物IL-10与TGF-β1 的关系第20-21页
        1.2.1 IL-10的生物学功能第20页
        1.2.2 TGF-β1 的生物学功能第20-21页
        1.2.3 IL-10与TGF-β1 的关系第21页
    1.3 哺乳动物IL-10的转录调控第21-23页
        1.3.1 IL-10的启动子分析第21-22页
        1.3.2 AP1对IL-10启动子活性的影响第22页
        1.3.3 CREB对IL-10启动子活性的影响第22-23页
        1.3.4 NF-κB对IL-10启动子活性的影响第23页
    1.4 鱼类IL-10的研究进展第23-24页
        1.4.1 鱼类IL-10的克隆鉴定第23-24页
        1.4.2 鱼类IL-10的功能研究第24页
    1.5 本论文的研究思路和研究意义第24页
    1.6 论文的主要研究内容和结构组成第24-26页
第二章 材料与方法第26-36页
    2.1 实验动物与细胞株第26页
        2.1.1 草鱼第26页
        2.1.2 草鱼肾细胞株CIK第26页
    2.2 基因克隆与载体构建第26-30页
        2.2.1 组织、细胞中的RNA提取第26-27页
        2.2.2 cDNA模板制备第27页
        2.2.3 cDNA部分序列的克隆第27页
        2.2.4 cDNA末端快速扩增(RACE)第27-28页
        2.2.5 实时荧光定量PCR第28页
        2.2.6 草鱼基因组提取、步移文库的构建及启动子的克隆第28-29页
        2.2.7 真核表达载体的构建第29页
        2.2.8 荧光素酶报告质粒的构建第29页
        2.2.9 生物信息学分析第29-30页
    2.3 原核重组表达系统的建立及重组蛋白的纯化第30-31页
        2.3.1 重组表达载体的构建第30页
        2.3.2 重组蛋白的诱导表达第30-31页
        2.3.3 重组蛋白的纯化第31页
    2.4 草鱼原代细胞的分离及培养第31-32页
        2.4.1 草鱼外周血淋巴细胞(PBLs)的分离与培养第31页
        2.4.2 草鱼头肾白细胞(HKLs)的分离与培养第31-32页
        2.4.3 草鱼头肾单核/巨噬细胞的分离与培养第32页
    2.5 细胞活性检测第32-33页
    2.6 免疫印迹实验(Western Blotting,WB)第33页
    2.7 定点突变质粒的构建第33页
    2.8 荧光素酶活性的检测第33-34页
    2.9 多克隆抗体的制备及验证第34页
    2.10 抗体的辣根过氧化物酶标记第34页
    2.11 竞争-抑制酶联免疫吸附实验(Competitive-Inhibition ELISA,CI-ELISA)第34-35页
    2.12 实验数据的统计学分析第35-36页
第三章 重组草鱼IL-10蛋白的活性鉴定和参与的免疫刺激作用第36-47页
    3.1 概述第36页
    3.2 材料与方法第36-38页
        3.2.1 实验材料第36-37页
        3.2.2 草鱼IL-10的基因克隆第37页
        3.2.3 草鱼IL-10的表达分析第37页
        3.2.4 草鱼IL-10的重组表达与纯化第37页
        3.2.5 草鱼IL-10多克隆抗体的制备及验证第37-38页
        3.2.6 草鱼IL-10抗体的辣根过氧化物酶标记第38页
        3.2.7 草鱼外周血淋巴细胞的分离第38页
        3.2.8 重组草鱼IL-10的生物学活性鉴定第38页
        3.2.9 草鱼IL-10的mRNA检测第38页
        3.2.10 草鱼IL-10分泌蛋白的检测第38页
        3.2.11 免疫中和实验第38页
        3.2.12 统计学分析第38页
    3.3 实验结果与分析第38-45页
        3.3.1 草鱼IL-10的分子克隆与生物信息学分析第38-40页
        3.3.2 草鱼IL-10的表达分析第40页
        3.3.3 草鱼IL-10的重组表达与分离纯化第40-41页
        3.3.4 草鱼IL-10促进外周血淋巴细胞PBLs的细胞活性第41-42页
        3.3.5 重组草鱼TGF-β1 上调PBLs的细胞活性第42页
        3.3.6 草鱼TGF-β1 通过IL-10上调PBLs的细胞活性第42-45页
        3.3.7 重组草鱼TGF-β1 上调IL-10的mRNA表达和蛋白分泌第45页
    3.4 讨论第45-46页
    3.5 本章小结第46-47页
第四章 草鱼IL-10与TGF-β1 在炎症反应调节中的作用和相互关系第47-57页
    4.1 概述第47-48页
    4.2 材料与方法第48-49页
        4.2.1 实验材料第48页
        4.2.2 草鱼头肾单核/巨噬细胞的分离第48页
        4.2.3 重组草鱼IL-10与TGF-β1 的免疫抑制功能鉴定第48页
        4.2.4 草鱼IL-10和TGF-β1 分泌蛋白的检测第48页
        4.2.5 免疫中和实验第48-49页
        4.2.6 草鱼IκBα 的免疫印迹实验第49页
        4.2.7 统计学分析第49页
    4.3 实验结果与分析第49-55页
        4.3.1 LPS刺激草鱼头肾单核/巨噬细胞促炎因子的表达第49-50页
        4.3.2 LPS刺激草鱼头肾单核/巨噬细胞抑炎因子的表达和蛋白分泌第50页
        4.3.3 草鱼IL-10抑制激活的单核/巨噬细胞中促炎因子的表达第50-51页
        4.3.4 草鱼TGF-β1 抑制激活的单核/巨噬细胞中促炎因子的表达第51页
        4.3.5 LPS激活条件下的内源IL-10和TGF-β1 调控促炎因子的表达第51-52页
        4.3.6 草鱼IL-10与TGF-β1 抑制LPS引起的NF-κB信号通路的激活第52页
        4.3.7 草鱼IL-10与TGF-β1 独立抑制促炎因子的表达第52-55页
    4.4 讨论第55-56页
    4.5 本章小结第56-57页
第五章 草鱼IL-10受体及信号通路的鉴定第57-74页
    5.1 概述第57-58页
    5.2 材料与方法第58-62页
        5.2.1 实验材料第58页
        5.2.2 草鱼IL-10R1、CRFB4与CRFB5的基因克隆第58-59页
        5.2.3 草鱼IL-10R1、CRFB4与CRFB5的表达分析第59页
        5.2.4 草鱼SOCS3启动子的克隆第59页
        5.2.5 草鱼IL-10R1、CRFB4与CRFB5真核表达载体的构建第59-60页
        5.2.6 草鱼SOCS3启动子报告质粒的构建第60页
        5.2.7 草鱼SOCS3启动子点突变报告质粒的构建第60页
        5.2.8 草鱼肾细胞系CIK的瞬时转染及CIK中IL-10信号通路鉴定第60-61页
            5.2.8.1 CIK细胞的瞬时转染第60-61页
            5.2.8.2 荧光素酶活性的检测第61页
        5.2.9 草鱼头肾白细胞HKLs的分离第61页
        5.2.10 重组草鱼IL-10蛋白对HKLs中SOCS3表达的调控第61页
        5.2.11 STAT3磷酸化的免疫印迹检测第61页
        5.2.12 统计学分析第61-62页
    5.3 实验结果与分析第62-71页
        5.3.1 草鱼IL-10R1、CRFB4与CRFB5 cDNA克隆与生物信息学分析第62-66页
        5.3.2 草鱼IL-10R1、CRFB4和CRFB5的表达分析第66-67页
        5.3.3 草鱼SOCS3的启动子克隆与分析第67页
        5.3.4 草鱼IL-10受体及其信号通路的鉴定第67-69页
        5.3.5 在HKLs中,IL-10对SOCS3的调控及其信号通路第69-71页
    5.4 讨论第71-72页
    5.5 本章小结第72-74页
第六章 草鱼IL-10的转录调控第74-82页
    6.1 概述第74-75页
    6.2 材料与方法第75-76页
        6.2.1 实验材料第75页
        6.2.2 LPS、重组草鱼IFN-γ 在单核/巨噬细胞中对IL-10 mRNA的调控第75页
        6.2.3 草鱼IL-10启动子的分离鉴定第75-76页
        6.2.4 LPS和重组草鱼IFN-γ 对IL-10启动子的调控第76页
        6.2.5 统计学分析第76页
    6.3 实验结果与分析第76-80页
        6.3.1 LPS促进IL-10 mRNA的表达及参与的细胞通路第76页
        6.3.2 重组草鱼IFN-γ 抑制IL-10 mRNA的表达及参与的信号通路第76-78页
        6.3.3 LPS上调草鱼IL-10的启动子活性第78页
        6.3.4 重组草鱼IFN-γ 抑制草鱼IL-10的启动子活性第78-79页
        6.3.5 重组草鱼IFN-γ 抑制LPS诱导的IL-10的转录第79-80页
    6.4 讨论第80-81页
    6.5 本章小结第81-82页
第七章 结论与展望第82-84页
致谢第84-85页
参考文献第85-102页
攻读博士期间取得的成果第102-104页

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