| 摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 第一章 绪论 | 第17-26页 |
| 1.1 哺乳动物IL-10及其受体和下游细胞信号通路 | 第17-20页 |
| 1.1.1 IL-10的分子结构 | 第17-18页 |
| 1.1.2 IL-10的分泌细胞 | 第18页 |
| 1.1.3 IL-10的I型受体 | 第18页 |
| 1.1.4 IL-10的II型受体 | 第18-19页 |
| 1.1.5 IL-10介导的JAK/STAT信号通路 | 第19-20页 |
| 1.2 哺乳动物IL-10与TGF-β1 的关系 | 第20-21页 |
| 1.2.1 IL-10的生物学功能 | 第20页 |
| 1.2.2 TGF-β1 的生物学功能 | 第20-21页 |
| 1.2.3 IL-10与TGF-β1 的关系 | 第21页 |
| 1.3 哺乳动物IL-10的转录调控 | 第21-23页 |
| 1.3.1 IL-10的启动子分析 | 第21-22页 |
| 1.3.2 AP1对IL-10启动子活性的影响 | 第22页 |
| 1.3.3 CREB对IL-10启动子活性的影响 | 第22-23页 |
| 1.3.4 NF-κB对IL-10启动子活性的影响 | 第23页 |
| 1.4 鱼类IL-10的研究进展 | 第23-24页 |
| 1.4.1 鱼类IL-10的克隆鉴定 | 第23-24页 |
| 1.4.2 鱼类IL-10的功能研究 | 第24页 |
| 1.5 本论文的研究思路和研究意义 | 第24页 |
| 1.6 论文的主要研究内容和结构组成 | 第24-26页 |
| 第二章 材料与方法 | 第26-36页 |
| 2.1 实验动物与细胞株 | 第26页 |
| 2.1.1 草鱼 | 第26页 |
| 2.1.2 草鱼肾细胞株CIK | 第26页 |
| 2.2 基因克隆与载体构建 | 第26-30页 |
| 2.2.1 组织、细胞中的RNA提取 | 第26-27页 |
| 2.2.2 cDNA模板制备 | 第27页 |
| 2.2.3 cDNA部分序列的克隆 | 第27页 |
| 2.2.4 cDNA末端快速扩增（RACE） | 第27-28页 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR | 第28页 |
| 2.2.6 草鱼基因组提取、步移文库的构建及启动子的克隆 | 第28-29页 |
| 2.2.7 真核表达载体的构建 | 第29页 |
| 2.2.8 荧光素酶报告质粒的构建 | 第29页 |
| 2.2.9 生物信息学分析 | 第29-30页 |
| 2.3 原核重组表达系统的建立及重组蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| 2.3.1 重组表达载体的构建 | 第30页 |
| 2.3.2 重组蛋白的诱导表达 | 第30-31页 |
| 2.3.3 重组蛋白的纯化 | 第31页 |
| 2.4 草鱼原代细胞的分离及培养 | 第31-32页 |
| 2.4.1 草鱼外周血淋巴细胞（PBLs）的分离与培养 | 第31页 |
| 2.4.2 草鱼头肾白细胞（HKLs）的分离与培养 | 第31-32页 |
| 2.4.3 草鱼头肾单核/巨噬细胞的分离与培养 | 第32页 |
| 2.5 细胞活性检测 | 第32-33页 |
| 2.6 免疫印迹实验（Western Blotting，WB） | 第33页 |
| 2.7 定点突变质粒的构建 | 第33页 |
| 2.8 荧光素酶活性的检测 | 第33-34页 |
| 2.9 多克隆抗体的制备及验证 | 第34页 |
| 2.10 抗体的辣根过氧化物酶标记 | 第34页 |
| 2.11 竞争-抑制酶联免疫吸附实验（Competitive-Inhibition ELISA，CI-ELISA） | 第34-35页 |
| 2.12 实验数据的统计学分析 | 第35-36页 |
| 第三章 重组草鱼IL-10蛋白的活性鉴定和参与的免疫刺激作用 | 第36-47页 |
| 3.1 概述 | 第36页 |
| 3.2 材料与方法 | 第36-38页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第36-37页 |
| 3.2.2 草鱼IL-10的基因克隆 | 第37页 |
| 3.2.3 草鱼IL-10的表达分析 | 第37页 |
| 3.2.4 草鱼IL-10的重组表达与纯化 | 第37页 |
| 3.2.5 草鱼IL-10多克隆抗体的制备及验证 | 第37-38页 |
| 3.2.6 草鱼IL-10抗体的辣根过氧化物酶标记 | 第38页 |
| 3.2.7 草鱼外周血淋巴细胞的分离 | 第38页 |
| 3.2.8 重组草鱼IL-10的生物学活性鉴定 | 第38页 |
| 3.2.9 草鱼IL-10的mRNA检测 | 第38页 |
| 3.2.10 草鱼IL-10分泌蛋白的检测 | 第38页 |
| 3.2.11 免疫中和实验 | 第38页 |
| 3.2.12 统计学分析 | 第38页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第38-45页 |
| 3.3.1 草鱼IL-10的分子克隆与生物信息学分析 | 第38-40页 |
| 3.3.2 草鱼IL-10的表达分析 | 第40页 |
| 3.3.3 草鱼IL-10的重组表达与分离纯化 | 第40-41页 |
| 3.3.4 草鱼IL-10促进外周血淋巴细胞PBLs的细胞活性 | 第41-42页 |
| 3.3.5 重组草鱼TGF-β1 上调PBLs的细胞活性 | 第42页 |
| 3.3.6 草鱼TGF-β1 通过IL-10上调PBLs的细胞活性 | 第42-45页 |
| 3.3.7 重组草鱼TGF-β1 上调IL-10的mRNA表达和蛋白分泌 | 第45页 |
| 3.4 讨论 | 第45-46页 |
| 3.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第四章 草鱼IL-10与TGF-β1 在炎症反应调节中的作用和相互关系 | 第47-57页 |
| 4.1 概述 | 第47-48页 |
| 4.2 材料与方法 | 第48-49页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第48页 |
| 4.2.2 草鱼头肾单核/巨噬细胞的分离 | 第48页 |
| 4.2.3 重组草鱼IL-10与TGF-β1 的免疫抑制功能鉴定 | 第48页 |
| 4.2.4 草鱼IL-10和TGF-β1 分泌蛋白的检测 | 第48页 |
| 4.2.5 免疫中和实验 | 第48-49页 |
| 4.2.6 草鱼IκBα 的免疫印迹实验 | 第49页 |
| 4.2.7 统计学分析 | 第49页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第49-55页 |
| 4.3.1 LPS刺激草鱼头肾单核/巨噬细胞促炎因子的表达 | 第49-50页 |
| 4.3.2 LPS刺激草鱼头肾单核/巨噬细胞抑炎因子的表达和蛋白分泌 | 第50页 |
| 4.3.3 草鱼IL-10抑制激活的单核/巨噬细胞中促炎因子的表达 | 第50-51页 |
| 4.3.4 草鱼TGF-β1 抑制激活的单核/巨噬细胞中促炎因子的表达 | 第51页 |
| 4.3.5 LPS激活条件下的内源IL-10和TGF-β1 调控促炎因子的表达 | 第51-52页 |
| 4.3.6 草鱼IL-10与TGF-β1 抑制LPS引起的NF-κB信号通路的激活 | 第52页 |
| 4.3.7 草鱼IL-10与TGF-β1 独立抑制促炎因子的表达 | 第52-55页 |
| 4.4 讨论 | 第55-56页 |
| 4.5 本章小结 | 第56-57页 |
| 第五章 草鱼IL-10受体及信号通路的鉴定 | 第57-74页 |
| 5.1 概述 | 第57-58页 |
| 5.2 材料与方法 | 第58-62页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第58页 |
| 5.2.2 草鱼IL-10R1、CRFB4与CRFB5的基因克隆 | 第58-59页 |
| 5.2.3 草鱼IL-10R1、CRFB4与CRFB5的表达分析 | 第59页 |
| 5.2.4 草鱼SOCS3启动子的克隆 | 第59页 |
| 5.2.5 草鱼IL-10R1、CRFB4与CRFB5真核表达载体的构建 | 第59-60页 |
| 5.2.6 草鱼SOCS3启动子报告质粒的构建 | 第60页 |
| 5.2.7 草鱼SOCS3启动子点突变报告质粒的构建 | 第60页 |
| 5.2.8 草鱼肾细胞系CIK的瞬时转染及CIK中IL-10信号通路鉴定 | 第60-61页 |
| 5.2.8.1 CIK细胞的瞬时转染 | 第60-61页 |
| 5.2.8.2 荧光素酶活性的检测 | 第61页 |
| 5.2.9 草鱼头肾白细胞HKLs的分离 | 第61页 |
| 5.2.10 重组草鱼IL-10蛋白对HKLs中SOCS3表达的调控 | 第61页 |
| 5.2.11 STAT3磷酸化的免疫印迹检测 | 第61页 |
| 5.2.12 统计学分析 | 第61-62页 |
| 5.3 实验结果与分析 | 第62-71页 |
| 5.3.1 草鱼IL-10R1、CRFB4与CRFB5 cDNA克隆与生物信息学分析 | 第62-66页 |
| 5.3.2 草鱼IL-10R1、CRFB4和CRFB5的表达分析 | 第66-67页 |
| 5.3.3 草鱼SOCS3的启动子克隆与分析 | 第67页 |
| 5.3.4 草鱼IL-10受体及其信号通路的鉴定 | 第67-69页 |
| 5.3.5 在HKLs中，IL-10对SOCS3的调控及其信号通路 | 第69-71页 |
| 5.4 讨论 | 第71-72页 |
| 5.5 本章小结 | 第72-74页 |
| 第六章 草鱼IL-10的转录调控 | 第74-82页 |
| 6.1 概述 | 第74-75页 |
| 6.2 材料与方法 | 第75-76页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第75页 |
| 6.2.2 LPS、重组草鱼IFN-γ 在单核/巨噬细胞中对IL-10 mRNA的调控 | 第75页 |
| 6.2.3 草鱼IL-10启动子的分离鉴定 | 第75-76页 |
| 6.2.4 LPS和重组草鱼IFN-γ 对IL-10启动子的调控 | 第76页 |
| 6.2.5 统计学分析 | 第76页 |
| 6.3 实验结果与分析 | 第76-80页 |
| 6.3.1 LPS促进IL-10 mRNA的表达及参与的细胞通路 | 第76页 |
| 6.3.2 重组草鱼IFN-γ 抑制IL-10 mRNA的表达及参与的信号通路 | 第76-78页 |
| 6.3.3 LPS上调草鱼IL-10的启动子活性 | 第78页 |
| 6.3.4 重组草鱼IFN-γ 抑制草鱼IL-10的启动子活性 | 第78-79页 |
| 6.3.5 重组草鱼IFN-γ 抑制LPS诱导的IL-10的转录 | 第79-80页 |
| 6.4 讨论 | 第80-81页 |
| 6.5 本章小结 | 第81-82页 |
| 第七章 结论与展望 | 第82-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-102页 |
| 攻读博士期间取得的成果 | 第102-104页 |
