| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1 引言 | 第13-25页 |
| 1.1 铜绿假单胞杆菌 | 第13-16页 |
| 1.1.1 铜绿假单胞杆菌的毒力因子 | 第13-15页 |
| 1.1.2 铜绿假单胞杆菌的Ⅲ型分泌系统 | 第15-16页 |
| 1.1.3 铜绿假单胞杆菌多重耐药性的基础 | 第16页 |
| 1.2 纤溶酶原与病原入侵 | 第16-19页 |
| 1.2.1 纤溶酶原的结构和功能 | 第16-18页 |
| 1.2.2 病原菌利用宿主Plg的机制 | 第18-19页 |
| 1.3 铜绿假单胞杆菌表面的纤溶酶原受体 | 第19-21页 |
| 1.3.1 铜绿假单胞杆菌表面的纤溶酶原受体 | 第19-20页 |
| 1.3.2 铜绿假单胞杆菌延长因子Tu结构 | 第20-21页 |
| 1.4 脂蛋白(a) | 第21-23页 |
| 1.4.1 Lp(a)结构 | 第21-22页 |
| 1.4.2 Lp(a)在纤溶系统中的作用 | 第22页 |
| 1.4.3 脂蛋白(a)的致病性 | 第22-23页 |
| 1.5 立题依据 | 第23页 |
| 1.6 研究内容 | 第23-25页 |
| 1.6.1 铜绿假单胞杆菌与Lp(a)的结合 | 第24页 |
| 1.6.2 重组铜绿假单胞杆菌翻译延长因子Tu与Lp(a)的结合 | 第24-25页 |
| 2 实验材料 | 第25-31页 |
| 2.1 仪器设备 | 第25页 |
| 2.2 主要试剂 | 第25-31页 |
| 2.2.1 化学试剂 | 第25-27页 |
| 2.2.2 试剂盒和标准品 | 第27页 |
| 2.2.3 填料及纯化缓冲液 | 第27-29页 |
| 2.2.4 培养基的配制 | 第29-30页 |
| 2.2.5 菌株及实验动物 | 第30页 |
| 2.2.6 PCR引物 | 第30-31页 |
| 3 实验方法 | 第31-48页 |
| 3.1 rTu的表达、纯化 | 第31-38页 |
| 3.1.1 铜绿假单胞杆菌的培养 | 第31页 |
| 3.1.2 铜绿假单胞杆菌基因组DNA的提取 | 第31-32页 |
| 3.1.3 基因组DNA的测定 | 第32页 |
| 3.1.4 Tu的扩增 | 第32页 |
| 3.1.5 Tu扩增产物的纯化 | 第32-33页 |
| 3.1.6 Tu与pGM-T的连接 | 第33页 |
| 3.1.7 pGM-T-Tu转化感受态E.coli | 第33页 |
| 3.1.8 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第33-34页 |
| 3.1.9 基因序列测定 | 第34页 |
| 3.1.10 Tu的酶切及纯化 | 第34页 |
| 3.1.11 提取pASK-IBA37质粒 | 第34-35页 |
| 3.1.12 pASK-IBA 37的酶切及纯化 | 第35页 |
| 3.1.13 Tu基因酶切产物与pASK-IBA 37载体的连接 | 第35-36页 |
| 3.1.14 pASK-IBA37-Tu转化感受态E.coli BL21 | 第36页 |
| 3.1.15 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第36页 |
| 3.1.16 阳性克隆的双酶切鉴定 | 第36页 |
| 3.1.17 工程菌培养 | 第36-37页 |
| 3.1.18 表达产物的分析 | 第37页 |
| 3.1.19 rTu的纯化 | 第37-38页 |
| 3.1.20 蛋白浓度的测定 | 第38页 |
| 3.2 rTA的表达和纯化 | 第38-39页 |
| 3.2.1 TA的扩增及纯化 | 第38-39页 |
| 3.2.2 TA的酶切及纯化 | 第39页 |
| 3.2.3 TA与pASK-IBA37的连接 | 第39页 |
| 3.2.4 pASK-IBA37-TA转化感受态E.coli | 第39页 |
| 3.2.5 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第39页 |
| 3.2.6 基因序列的测定 | 第39页 |
| 3.2.7 工程菌的培养 | 第39页 |
| 3.2.8 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第39页 |
| 3.2.9 rTA的纯化 | 第39页 |
| 3.2.10 蛋白浓度的测定 | 第39页 |
| 3.3 rT1或rT2的表达和纯化 | 第39-40页 |
| 3.3.1 T1、T2的扩增及纯化 | 第39-40页 |
| 3.3.2 T1或T2的酶切及纯化 | 第40页 |
| 3.3.3 T1或T2与pASK-IBA37的连接 | 第40页 |
| 3.3.4 pASK-IBA37-T1或pASK-IBA37-T2转化感受态E.coli | 第40页 |
| 3.3.5 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第40页 |
| 3.3.6 基因序列的测定 | 第40页 |
| 3.3.7 工程菌的培养 | 第40页 |
| 3.3.8 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第40页 |
| 3.3.9 rT1或rT2的纯化 | 第40页 |
| 3.3.10 蛋白浓度的测定 | 第40页 |
| 3.4 探索铜绿假单胞杆菌与Lp(a)的相互作用 | 第40-42页 |
| 3.4.1 检测铜绿假单胞杆菌与Plg或Lp(a)的结合 | 第40-41页 |
| 3.4.2 检测EACA对铜绿假单胞杆菌与Plg或Lp(a)结合的作用 | 第41-42页 |
| 3.5 探索rTu与Lp(a)的相互作用 | 第42-43页 |
| 3.5.1 检测rTu与Plg、Lp(a)或LDL的结合 | 第42-43页 |
| 3.5.2 检测EACA对rTu与Pig或Lp(a)结合的抑制作用 | 第43页 |
| 3.5.3 检测Lp(a)对rTu与Plg结合的抑制作用 | 第43页 |
| 3.6 检测rTu、rTA、rT1或rT2与Plg或Lp(a)的结合 | 第43-44页 |
| 3.6.1 检测rTu、rTA、rT1或rT2与Plg的结合 | 第44页 |
| 3.6.2 检测rTu、rTA、rT1或rT2与Lp(a)的结合 | 第44页 |
| 3.7 rTu抗体的制备及纯化 | 第44-46页 |
| 3.7.1 免疫用试剂的制备 | 第44页 |
| 3.7.2 rTu免疫小鼠 | 第44-45页 |
| 3.7.3 rTu抗体的纯化 | 第45页 |
| 3.7.4 检测rTu抗体的稀释比 | 第45-46页 |
| 3.8 用rTu抗体研究rTu或铜绿假单胞杆菌与Lp(a)的相互作用 | 第46-48页 |
| 3.8.1 检测不同生长时期铜绿假单胞杆菌表面Tu的表达量 | 第46页 |
| 3.8.2 检测rTu抗体对铜绿假单胞杆菌与Lp(a)结合的作用 | 第46-48页 |
| 4 结果 | 第48-68页 |
| 4.1 rTu的表达和纯化 | 第48-55页 |
| 4.1.1 铜绿假单胞杆菌在TSB培养基中的生长曲线 | 第48页 |
| 4.1.2 铜绿假单胞杆菌基因组DNA的提取 | 第48-49页 |
| 4.1.3 pGM-T质粒示意图 | 第49页 |
| 4.1.4 Tu基因的扩增 | 第49页 |
| 4.1.5 重组质粒pGM-T-Tu的构建 | 第49-50页 |
| 4.1.6 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第50页 |
| 4.1.7 Tu序列测定结果 | 第50-51页 |
| 4.1.8 pASK-IBA37载体 | 第51页 |
| 4.1.9 pASK-IBA37的酶切及纯化 | 第51-52页 |
| 4.1.10 Tu的双酶切及纯化 | 第52页 |
| 4.1.11 Tu与pASK-IBA37的连接 | 第52页 |
| 4.1.12 菌落PCR鉴定阳性转化菌落 | 第52-53页 |
| 4.1.13 BamHI、EcoRI双酶切pASK-IBA37-Tu质粒 | 第53页 |
| 4.1.14 表达产物的分析 | 第53-54页 |
| 4.1.15 rTu的纯化 | 第54页 |
| 4.1.16 蛋白含量的测定 | 第54-55页 |
| 4.2 rTA的表达和纯化 | 第55-56页 |
| 4.2.1 TA的扩增及纯化 | 第55页 |
| 4.2.2 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第55-56页 |
| 4.2.3 TA序列测定结果 | 第56页 |
| 4.2.4 rTA的表达纯化 | 第56页 |
| 4.2.5 蛋白含量的测定 | 第56页 |
| 4.3 rT1、rT2的表达和纯化 | 第56-58页 |
| 4.3.1 T1、T2的扩增及纯化 | 第56-57页 |
| 4.3.2 菌落PCR鉴定T1或T2阳性克隆 | 第57页 |
| 4.3.3 rT1、rT2的表达纯化 | 第57-58页 |
| 4.3.4 蛋白浓度的测定 | 第58页 |
| 4.4 探索铜绿假单胞杆菌与Lp(a)的相互作用 | 第58-60页 |
| 4.4.1 检测铜绿假单胞杆菌与Plg或Lp(a)的结合 | 第58-59页 |
| 4.4.2 检测EACA对铜绿假单胞杆菌与Plg或Lp(a)结合的作用 | 第59-60页 |
| 4.5 rTu与Lp(a)的相互作用 | 第60-63页 |
| 4.5.1 ELISA检测rTu与Plg、Lp(a)或LDL的结合 | 第60-61页 |
| 4.5.2 检测EACA对rTu与Plg或Lp(a)结合的作用 | 第61-62页 |
| 4.5.3 检测Lp(a)对rTu与Plg结合的作用 | 第62-63页 |
| 4.6 ELISA检测rTA、rT1或rT2与Plg或Lp(a)的相互作用 | 第63-64页 |
| 4.6.1 ELISA检测rTu、rTA、rT1或rT2与Plg的结合 | 第63页 |
| 4.6.2 ELISA检测rTu、rTA、rT1或rT2与Lp(a)的结合 | 第63-64页 |
| 4.7 rTu抗体的制备和纯化 | 第64页 |
| 4.8 探索rTu抗体的稀释比 | 第64-66页 |
| 4.8.1 rTu抗体与rTu结合时的稀释比 | 第64-65页 |
| 4.8.2 rTu抗体与铜绿假单胞杆菌结合时的稀释比 | 第65-66页 |
| 4.9 rTu抗体对rTu或铜绿假单胞杆菌与Lp(a)结合的作用 | 第66-68页 |
| 4.9.1 不同生长时期铜绿假单胞杆菌表面Tu表达量的差异 | 第66页 |
| 4.9.2 rTu抗体对铜绿假单胞杆菌或rTu与Lp(a)结合的作用 | 第66-68页 |
| 5 讨论 | 第68-69页 |
| 6 结论 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-75页 |
| 附录 | 第75-80页 |
| 作者简介 | 第80页 |
