| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第9-16页 |
| 1.1 L-苹果酸概述 | 第9页 |
| 1.2 L-苹果酸的生产方法 | 第9-13页 |
| 1.2.1 化学法合成L-苹果酸的研究概况 | 第10页 |
| 1.2.2 酶转化法生产L-苹果酸研究的进展 | 第10-11页 |
| 1.2.3 天然微生物生产L-苹果酸研究的进展 | 第11-12页 |
| 1.2.4 工程菌生产L-苹果酸研究进展 | 第12-13页 |
| 1.3 L-苹果酸合成路径 | 第13-14页 |
| 1.3.1 L-苹果酸代谢途径解析 | 第13-14页 |
| 1.3.2 苹果酸酶在L-苹果酸合成中的应用 | 第14页 |
| 1.4 本论文的研究背景和意义 | 第14-15页 |
| 1.5 本论文主要研究内容 | 第15-16页 |
| 第二章 材料与方法 | 第16-26页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第16-17页 |
| 2.2 仪器与材料 | 第17-18页 |
| 2.2.1 仪器 | 第17页 |
| 2.2.2 材料 | 第17-18页 |
| 2.3 大肠杆菌基因敲除 | 第18-20页 |
| 2.3.1 制作电转化感受态 | 第19页 |
| 2.3.2 pKD46质粒电击转化 | 第19页 |
| 2.3.3 同源重组阳性克隆的获得 | 第19-20页 |
| 2.3.4 卡那霉素抗性消除 | 第20页 |
| 2.4 质粒构建 | 第20-23页 |
| 2.4.1 目的基因的获取 | 第20页 |
| 2.4.2 苹果酸酶表达载体的构建 | 第20-21页 |
| 2.4.3 苹果酸酶NADP-ME2突变体的构建 | 第21-23页 |
| 2.4.4 辅因子循环系统的构建 | 第23页 |
| 2.5 培养基和培养条件 | 第23-24页 |
| 2.5.1 培养基 | 第23页 |
| 2.5.2 发酵条件 | 第23-24页 |
| 2.6 分析方法 | 第24-26页 |
| 2.6.1 苹果酸酶酶活力测定 | 第24页 |
| 2.6.2 突变体C490S动力学参数测定 | 第24页 |
| 2.6.3 发酵液成分含量测定 | 第24-25页 |
| 2.6.4 胞内NADPH、NADH和NAD+含量测定 | 第25-26页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第26-42页 |
| 3.1 构建高产丙酮酸的E. coli底盘微生物 | 第26-29页 |
| 3.1.1 丙酮酸高产菌株的构建与验证 | 第26-27页 |
| 3.1.2 多基因组合敲除对细胞生长和葡萄糖消耗的影响 | 第27-28页 |
| 3.1.3 多基因组合敲除对工程菌积累丙酮酸的影响 | 第28-29页 |
| 3.1.4 小结 | 第29页 |
| 3.2 苹果酸一步合成途径的构建 | 第29-34页 |
| 3.2.1 苹果酸酶基因克隆及表达载体的构建 | 第29-30页 |
| 3.2.2 体外转化筛选用于苹果酸生产的苹果酸酶 | 第30-31页 |
| 3.2.3 蛋白质工程改造NADP-ME2逆向反应能力 | 第31-32页 |
| 3.2.4 NADPH和碳酸氢根离子浓度对C490S生产L-苹果酸的影响 | 第32-33页 |
| 3.2.5 C490S表达对E. coli F0501生产L-苹果酸的影响 | 第33-34页 |
| 3.2.6 小结 | 第34页 |
| 3.3 全局优化提高工程菌的L-苹果酸生产性能 | 第34-40页 |
| 3.3.1 frdBC、fumB和fumAC基因组合敲除菌株的构建 | 第34-35页 |
| 3.3.2 敲除frdBC、fumB和fumAC基因对E. coliF0511积累L-苹果酸的影响 | 第35-36页 |
| 3.3.3 ldhA和pos5基因表达菌株的构建与验证 | 第36-37页 |
| 3.3.4 ldhA和pos5基因表达对工程菌E. coliF0911生长性能的影响 | 第37-38页 |
| 3.3.5 ldhA和pos5基因表达对工程菌E. coliF0911生产L-苹果酸的影响 | 第38-39页 |
| 3.3.6 小结 | 第39-40页 |
| 3.4 培养条件优化提高L-苹果酸产量 | 第40-42页 |
| 3.4.1 细胞浓度对E. coliF0931生产L-苹果酸的影响 | 第40-41页 |
| 3.4.2 发酵过程控制提高L-苹果酸产量 | 第41页 |
| 3.4.3 小结 | 第41-42页 |
| 主要结论与展望 | 第42-44页 |
| 致谢 | 第44-45页 |
| 参考文献 | 第45-48页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第48页 |
