| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第1章 绪论 | 第13-24页 |
| 1.1 选题意义 | 第13-14页 |
| 1.2 血栓疾病与治疗 | 第14-16页 |
| 1.3 蚓激酶的研究现状 | 第16-18页 |
| 1.3.1 概述 | 第16页 |
| 1.3.2 蚓激酶的物理性质 | 第16-17页 |
| 1.3.3 蚓激酶的开发与利用 | 第17-18页 |
| 1.4 大肠杆菌表达系统概况 | 第18页 |
| 1.5 酵母表达系统概况 | 第18-22页 |
| 1.6 研究目的及内容 | 第22-24页 |
| 1.6.1 研究目的 | 第22-23页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第23-24页 |
| 第2章 蚓激酶基因的克隆及分析 | 第24-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-26页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 酶与试剂 | 第24页 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 | 第24-25页 |
| 2.1.4 培养基与溶液 | 第25-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-32页 |
| 2.2.1 实验样本的采集及处理 | 第26页 |
| 2.2.2 蚯蚓总RNA的提取 | 第26页 |
| 2.2.3 蚓激酶cDNA单链的合成 | 第26-27页 |
| 2.2.4 蚯蚓基因组的提取 | 第27页 |
| 2.2.5 引物设计 | 第27-28页 |
| 2.2.6 实验样本的18S序列的获取 | 第28页 |
| 2.2.7 蚓激酶基因的获取 | 第28-30页 |
| 2.2.8 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.2.9 18S基因、蚓激酶基因与pMD18-T载体的连接及转化 | 第30-31页 |
| 2.2.10 阳性转化子的筛选、验证和测序 | 第31页 |
| 2.2.11 生物信息学分析 | 第31-32页 |
| 2.3 实验结果 | 第32-37页 |
| 2.3.1 蚯蚓DNA和总RNA的提取 | 第32-33页 |
| 2.3.2 18S基因与蚓激酶基因的获得 | 第33页 |
| 2.3.3 基因与pMD18-T载体的连接、转化和阳性转化子的筛选 | 第33-34页 |
| 2.3.4 18S基因与蚓激酶基因序列分析 | 第34-36页 |
| 2.3.5 蚓激酶同源建模及分析 | 第36-37页 |
| 2.4 小结 | 第37-39页 |
| 第3章 蚓激酶基因Eflk的大肠杆菌BL21(DE3)中表达 | 第39-50页 |
| 3.1 实验材料 | 第39-41页 |
| 3.1.1 菌株、载体 | 第39页 |
| 3.1.2 酶与试剂 | 第39页 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 | 第39页 |
| 3.1.4 培养基与溶液 | 第39-41页 |
| 3.2 实验方法 | 第41-44页 |
| 3.2.1 pET-28a(+)质粒的提取 | 第41页 |
| 3.2.2 Eflk基因的扩增 | 第41页 |
| 3.2.3 蚓激酶基因Eflk重组质粒构建 | 第41-43页 |
| 3.2.4 重组菌构建 | 第43页 |
| 3.2.5 阳性转化子的筛选及验证 | 第43页 |
| 3.2.6 纤维蛋白平板制作及尿激酶标准曲线的制备 | 第43页 |
| 3.2.7 重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-Eflk的发酵 | 第43页 |
| 3.2.8 SDS-PAGE分析重组菌的表达 | 第43-44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-48页 |
| 3.3.1 质粒pET-28a(+)的提取 | 第44-45页 |
| 3.3.2 重组质粒pET-28a(+)-Eflk的构建 | 第45页 |
| 3.3.3 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化 | 第45页 |
| 3.3.4 阳性转化子的筛选及验证 | 第45-46页 |
| 3.3.5 重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-Eflk的生长曲线 | 第46页 |
| 3.3.6 重组菌BL21 (DE3)-pET-28a(+)-Eflk的发酵 | 第46-48页 |
| 3.3.7 SDS-PAGE分析 | 第48页 |
| 3.4 小结 | 第48-50页 |
| 第4章 蚓激酶基因Eflk在巴斯德毕赤酵母中表达及发酵条件优化 | 第50-67页 |
| 4.1 实验材料 | 第50-51页 |
| 4.1.1 菌株、载体 | 第50页 |
| 4.1.2 酶与试剂 | 第50页 |
| 4.1.3 培养基与溶液 | 第50-51页 |
| 4.1.4 主要仪器与设备 | 第51页 |
| 4.2 实验方法 | 第51-57页 |
| 4.2.1 pPIC9K质粒的提取 | 第51页 |
| 4.2.2 蚓激酶EFLK基因的获得 | 第51页 |
| 4.2.3 重组质粒pPIC9K-Eflk的构建 | 第51-53页 |
| 4.2.4 重组质粒的鉴定 | 第53页 |
| 4.2.5 重组毕赤酵母细胞GS115-pPIC9K-Eflk构建 | 第53-54页 |
| 4.2.6 阳性转化子的筛选 | 第54页 |
| 4.2.7 重组菌GS115-pPIC9K-Eflk生长曲线测定 | 第54页 |
| 4.2.8 单因素实验 | 第54-55页 |
| 4.2.9 正交试验 | 第55-57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-66页 |
| 4.3.1 pPIC9K质粒的提取 | 第57页 |
| 4.3.2 重组质粒pPIC9K-Eflk的构建及验证 | 第57-58页 |
| 4.3.3 巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞的制备及转化 | 第58页 |
| 4.3.4 阳性转化子的筛选及验证 | 第58-59页 |
| 4.3.5 SDS-PAGE分析 | 第59-60页 |
| 4.3.6 重组菌GS115-pPIC9K-Eflk生长曲线测定 | 第60页 |
| 4.3.7 单因素实验 | 第60-65页 |
| 4.3.8 正交实验 | 第65-66页 |
| 4.4 小结 | 第66-67页 |
| 第5章 蚓激酶的分离纯化及性质研究 | 第67-75页 |
| 5.1 实验材料 | 第67-68页 |
| 5.1.1 菌种 | 第67页 |
| 5.1.2 主要仪器与设备 | 第67页 |
| 5.1.3 培养基与溶液 | 第67-68页 |
| 5.2 实验方法 | 第68-69页 |
| 5.2.1 样品预处理 | 第68页 |
| 5.2.2 硫酸铵沉淀 | 第68页 |
| 5.2.3 Ni~+柱分离目的蛋白 | 第68页 |
| 5.2.4 蚓激酶EFLK酶学性质 | 第68-69页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第69-74页 |
| 5.3.1 硫酸铵沉淀 | 第69-70页 |
| 5.3.2 目的蛋白的纯化 | 第70页 |
| 5.3.3 蚓激酶EFLK酶学性质 | 第70-74页 |
| 5.4 小结 | 第74-75页 |
| 第6章 结论与展望 | 第75-77页 |
| 结论 | 第75-76页 |
| 展望 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-85页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
