| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第1章 绪论 | 第11-29页 |
| ·cAMP的性质及研究意义 | 第11-15页 |
| ·cAMP的发现及理化性质研究 | 第11页 |
| ·cAMP的生物合成途径 | 第11-12页 |
| ·cAMP的生理功能 | 第12-14页 |
| ·cAMP在细胞内的状态及水平 | 第14-15页 |
| ·cAMP的常用检测手段 | 第15-20页 |
| ·放射免疫学方法 | 第15页 |
| ·酶联免疫测定法 | 第15页 |
| ·纸层析法 | 第15-16页 |
| ·高效液相色谱法 | 第16页 |
| ·均相时间分辨荧光 | 第16-17页 |
| ·构建cAMP敏感型荧光探针 | 第17-20页 |
| ·Epac蛋白的性质及研究意义 | 第20-23页 |
| ·发现 | 第20-21页 |
| ·结构特征 | 第21页 |
| ·功能特性及研究意义 | 第21-23页 |
| ·荧光蛋白的性质及研究意义 | 第23-27页 |
| ·荧光蛋白的结构特性 | 第23-25页 |
| ·荧光蛋白的应用 | 第25-26页 |
| ·荧光蛋白的研究意义 | 第26-27页 |
| ·Azurin蛋白的性质及研究意义 | 第27页 |
| ·Azurin的结构特性 | 第27页 |
| ·Azurin的功能及研究进展 | 第27页 |
| ·展望 | 第27-29页 |
| 第2章 Epac-cpYFP重组质粒的构建及鉴定 | 第29-45页 |
| ·实验材料 | 第29-31页 |
| ·菌株 | 第29页 |
| ·质粒 | 第29页 |
| ·试剂和酶 | 第29页 |
| ·主要仪器设备 | 第29页 |
| ·相关溶液及试剂配制 | 第29-31页 |
| ·实验方法 | 第31-39页 |
| ·实验流程 | 第31-34页 |
| ·重组质粒的构建 | 第34-38页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第38-39页 |
| ·实验结果 | 第39-41页 |
| ·目的基因Epac及荧光蛋白基因cpYFP片段扩增结果 | 第39页 |
| ·PCR产物回收及纯化 | 第39-40页 |
| ·菌落PCR鉴定结果 | 第40页 |
| ·不同模型截短质粒构建结果 | 第40-41页 |
| ·小结 | 第41-45页 |
| ·实验原理分析-靶蛋白的选择 | 第41-42页 |
| ·探针构建模型——荧光蛋白插入位点的选择 | 第42-44页 |
| ·设计方案的确立与优化 | 第44页 |
| ·结论与展望 | 第44-45页 |
| 第3章 Epac-cpYFP蛋白的表达、纯化及性质的初步研究 | 第45-62页 |
| ·实验材料 | 第45-50页 |
| ·菌株及质粒 | 第45-47页 |
| ·试剂 | 第47页 |
| ·实验仪器设备 | 第47页 |
| ·试剂配制 | 第47-50页 |
| ·实验方法 | 第50-55页 |
| ·实验流程图 | 第50页 |
| ·探针表达条件摸索 | 第50页 |
| ·荧光蛋白探针的表达 | 第50-51页 |
| ·荧光蛋白探针表达产物的获取 | 第51页 |
| ·荧光蛋白探针表达产物的纯化 | 第51-52页 |
| ·荧光蛋白探针表达产物的鉴定 | 第52-53页 |
| ·探针基本性质的检测 | 第53-55页 |
| ·实验结果 | 第55-59页 |
| ·表达纯化条件的摸索结果 | 第55页 |
| ·原始模型探针体外滴定结果 | 第55-56页 |
| ·E2B-445/446模型及Epacl模型截短体蛋白体外滴定结果 | 第56-57页 |
| ·初筛探针基本特性的体外测定 | 第57-59页 |
| ·小结 | 第59-62页 |
| ·实验原理分析 | 第59-60页 |
| ·蛋白表达纯化条件的选择与确定 | 第60页 |
| ·检测方法的建立 | 第60页 |
| ·结论与展望 | 第60-62页 |
| 第4章 Epac-cpYFP探针进一步优化及高通量筛选检测方法的建立 | 第62-80页 |
| ·实验材料 | 第62-63页 |
| ·菌株及质粒 | 第62-63页 |
| ·试剂和酶 | 第63页 |
| ·实验仪器设备 | 第63页 |
| ·试剂配制 | 第63页 |
| ·实验方法 | 第63-66页 |
| ·实验流程图 | 第63-64页 |
| ·Epac定点突变质粒的构建 | 第64-65页 |
| ·Epac随机突变质粒的构建 | 第65页 |
| ·高通量表达检测方法的建立 | 第65-66页 |
| ·实验结果 | 第66-75页 |
| ·高通量筛选检测条件摸索结果 | 第66-68页 |
| ·定点突变体系列探针表达检测结果 | 第68-69页 |
| ·随机突变系列探针高通量表达检测结果 | 第69-75页 |
| ·最优化探针的确立 | 第75页 |
| ·小结 | 第75-80页 |
| ·实验原理分析 | 第75-76页 |
| ·探针优化方法讨论 | 第76-78页 |
| ·结论与展望 | 第78-80页 |
| 第5章 Epac-cpYFP探针在活细胞内的检测及应用 | 第80-91页 |
| ·实验材料 | 第80-82页 |
| ·菌株及质粒 | 第80页 |
| ·试剂和酶 | 第80-81页 |
| ·实验仪器设备 | 第81页 |
| ·试剂配制 | 第81-82页 |
| ·实验方法 | 第82-88页 |
| ·较优探针cpYFP双突变体的构建 | 第82-83页 |
| ·大肠杆菌二次生长间歇期胞内cAMP水平的研究 | 第83-84页 |
| ·不同生理环境下大肠杆菌胞内cAMP水平的检测 | 第84-85页 |
| ·哺乳动物细胞内检测 | 第85-86页 |
| ·探针在cAMP参与的大肠杆菌代谢调控过程中的应用 | 第86-88页 |
| ·实验结果 | 第88-91页 |
| ·探针真核质粒构建情况 | 第88页 |
| ·大肠杆菌活细胞糖类利用过程中探针的检测应用 | 第88-90页 |
| ·哺乳动物细胞应激反应中探针的检测应用 | 第90-91页 |
| 第6章 Azurin重组蛋白及其荧光探针基本性质的研究 | 第91-100页 |
| ·实验材料 | 第91-92页 |
| ·菌株 | 第91页 |
| ·质粒 | 第91页 |
| ·试剂和酶 | 第91页 |
| ·主要仪器设备 | 第91-92页 |
| ·实验方法 | 第92-95页 |
| ·Azurin重组质粒及Azurin-mcherry荧光探针质粒构建 | 第92-93页 |
| ·Azurin及Azurin-mcherry系列荧光探针表达条件摸索 | 第93页 |
| ·Azurin及Azurin-mcherry系列荧光探针纯化方法的探究 | 第93-94页 |
| ·Azurin-mcherry系列荧光探针氧化还原性质检测 | 第94-95页 |
| ·实验结果 | 第95-98页 |
| ·Azurin基因片段扩增结果 | 第95页 |
| ·Azurin-mcherry系列探针构建 | 第95页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第95-96页 |
| ·重组蛋白纯化方法的建立 | 第96-97页 |
| ·Azurin原始蛋白及Azurin-mcherry系列蛋白光谱性质研究 | 第97-98页 |
| ·Azurin-mcherry系列荧光探针氧化过程中荧光检测结果 | 第98页 |
| ·小结 | 第98-100页 |
| ·Azurin及其荧光探针蛋白表达纯化方法的建立 | 第98页 |
| ·Azurin-mcherry系列荧光探针性质的研究 | 第98-99页 |
| ·结论与展望 | 第99-100页 |
| 第7章 结论 | 第100-102页 |
| ·cAMP敏感型荧光探针 | 第100-101页 |
| ·Azurin敏感型荧光探针 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-109页 |
| 致谢 | 第109页 |
