| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 文献综述 | 第14-21页 |
| 1 DVH概述 | 第14-20页 |
| ·DHAV的流行及分布 | 第14页 |
| ·DHAV的分类地位 | 第14-15页 |
| ·DHAV病原学特性 | 第15-16页 |
| ·DHAV分子生物学特性 | 第16-17页 |
| ·DHAV诊断方法的研究 | 第17-19页 |
| ·截短基因的表达 | 第19-20页 |
| 2 研究目的与意义 | 第20-21页 |
| 材料方法 | 第21-38页 |
| 1 试验材料 | 第21-24页 |
| ·毒株、动物、质粒和血清 | 第21页 |
| ·主要试剂 | 第21页 |
| ·主要仪器 | 第21-22页 |
| ·主要培养基和溶液的配置 | 第22-24页 |
| ·抗生素 | 第22页 |
| ·培养基类 | 第22页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳相关溶液 | 第22页 |
| ·Western blot相关溶液 | 第22页 |
| ·蛋白表达与检测的相关溶液 | 第22-23页 |
| ·纯化蛋白相关溶液 | 第23页 |
| ·纯化抗体相关溶液 | 第23页 |
| ·ELISA相关溶液 | 第23-24页 |
| 2 方法 | 第24-38页 |
| ·鸭甲型肝炎病毒的增殖与纯化 | 第24页 |
| ·VP0、VP1蛋白的分段设计与引物合成 | 第24-26页 |
| ·VP0、VP1截短基因的克隆 | 第26-29页 |
| ·病毒RNA的提取 | 第26页 |
| ·RT-PCR扩增及检测 | 第26页 |
| ·RT-PCR产物回收与纯化 | 第26-27页 |
| ·VP0F1-3、VP1F1-2五段截短基因的回收与纯化 | 第27-28页 |
| ·VP0、VP1截短基因与克隆载体的连接 | 第28页 |
| ·连接产物的转化 | 第28页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第28-29页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第29-31页 |
| ·带有粘性末端VP0、VP1截短基因片段和载体pET28a的制备 | 第29页 |
| ·VP0、VP1截短基因和载体pET28a的连接、转化及鉴定 | 第29-30页 |
| ·重组质粒pET28a-VP0/VP1(截短)质粒的酶切鉴定 | 第30页 |
| ·重组质粒pET28a-VP0/VP1(截短)质粒的PCR鉴定 | 第30-31页 |
| ·重组质粒的诱导表达及蛋白的纯化 | 第31-32页 |
| ·重组质粒的转化 | 第31页 |
| ·截短蛋白诱导表达最佳条件的摸索 | 第31页 |
| ·重组蛋白的可溶性分析 | 第31页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第31-32页 |
| ·重组蛋白浓度的测定 | 第32页 |
| ·重组蛋白Western blot检测 | 第32页 |
| ·间接ELISA检测方法的建立 | 第32-34页 |
| ·间接ELISA检测方法的操作步骤 | 第32页 |
| ·重组蛋白最佳包被浓度和最佳血清工作浓度的确定 | 第32-33页 |
| ·最佳包被条件的确定 | 第33页 |
| ·最佳封闭剂和封闭时间的确定 | 第33页 |
| ·血清最佳作用时间的确定 | 第33页 |
| ·酶标二抗最佳工作浓度和最佳作用时间的确定 | 第33页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第33-34页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第34页 |
| ·特异性试验 | 第34页 |
| ·敏感性试验 | 第34页 |
| ·重复性试验 | 第34页 |
| ·包被抗原保存期试验 | 第34页 |
| ·VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备 | 第34-36页 |
| ·日本大耳白兔的免疫 | 第34-35页 |
| ·抗血清的收集 | 第35页 |
| ·间接ELISA法检测抗体血清效价 | 第35页 |
| ·多克隆抗体的纯化 | 第35页 |
| ·多克隆抗体浓度的测定 | 第35-36页 |
| ·夹心ELISA检测方法的建立 | 第36-38页 |
| ·夹心ELISA方法的操作程序 | 第36页 |
| ·捕获抗体的选择 | 第36页 |
| ·最佳封闭剂和封闭时间的确定 | 第36-37页 |
| ·捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度的确定 | 第37页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第37页 |
| ·最佳抗原、鸭多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定 | 第37页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第37页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第37页 |
| ·特异性试验 | 第37页 |
| ·重复性试验 | 第37-38页 |
| 试验结果 | 第38-52页 |
| 1 鸭甲型肝炎病毒(DHAV-I)的浓度测定 | 第38页 |
| 2 VP0、VP1截短基因的克隆表达 | 第38-42页 |
| ·VP0、VP1基因RT-PCR的扩增结果 | 第38页 |
| ·VPOF1-3、VP1F1-2基因和VP0、VP1截短基因扩增结果 | 第38-40页 |
| ·pET28a-VP0/VP1(截短)重组表达质粒的鉴定 | 第40页 |
| ·截短蛋白诱导表达最佳条件的摸索及表达形式的鉴定 | 第40页 |
| ·可溶性截短蛋白的纯化及浓度的测定 | 第40-42页 |
| ·截短蛋白的Western blot结果 | 第42页 |
| 3 鸭肝炎病毒VP0截短蛋白间接ELISA检测方法的建立 | 第42-47页 |
| ·VP0截短蛋白最佳包被浓度和鸭血清稀释度的确定 | 第42-43页 |
| ·最佳包被条件的确定 | 第43页 |
| ·最佳封闭剂和封闭时间的确定 | 第43页 |
| ·血清最佳作用时间的确定 | 第43-44页 |
| ·酶标二抗最佳工作浓度和最佳作用时间的确定 | 第44页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第44-45页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第45页 |
| ·特异性试验 | 第45页 |
| ·敏感性试验 | 第45-46页 |
| ·重复性试验 | 第46页 |
| ·包被抗原保存期试验 | 第46-47页 |
| 4 VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备 | 第47页 |
| ·VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体效价的测定 | 第47页 |
| ·VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体浓度的测定 | 第47页 |
| 5 夹心ELISA检测方法的建立 | 第47-52页 |
| ·捕获抗体的确定 | 第47-48页 |
| ·最佳封闭剂和封闭时间的确定 | 第48页 |
| ·捕获抗体和检测抗体最佳浓度的确定 | 第48-49页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第49页 |
| ·最佳抗原、鸭多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定 | 第49-50页 |
| ·最佳显色时间的确定 | 第50页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第50页 |
| ·特异性试验 | 第50-51页 |
| ·重复性试验 | 第51-52页 |
| 讨论 | 第52-56页 |
| 1 VP0、VP1的截短表达 | 第52页 |
| 2 VP0、VP1截短蛋白的分析 | 第52-53页 |
| 3 间接ELISA检测方法 | 第53-54页 |
| 4 夹心ELISA检测方法 | 第54-56页 |
| 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
