| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-23页 |
| 1 前言 | 第12-16页 |
| ·NMD是真核细胞中mRNA降解的重要监督机制 | 第12-14页 |
| ·NMD途径的作用因子和底物基因 | 第14-16页 |
| ·NMD与疾病的关系 | 第16页 |
| 2 miRNA的生物过程及与靶基因的调控机制 | 第16-21页 |
| ·miRNA生物过程 | 第16-20页 |
| ·miRNA的检测方法 | 第18页 |
| ·miRNA的功能 | 第18-20页 |
| ·miRNA与动物生长发育的调控作用 | 第19页 |
| ·miRNA调控细胞增殖、分化和凋亡 | 第19-20页 |
| ·miRNA与肿瘤 | 第20页 |
| ·miRNA与靶基因的调控机制 | 第20-21页 |
| 3 miRNA靶基因的预测与检测方法 | 第21-22页 |
| 4 研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 材料方法 | 第23-50页 |
| 1 实验材料 | 第23-27页 |
| ·实验样品 | 第23-24页 |
| ·组织样品 | 第23页 |
| ·载体、菌株和细胞系 | 第23页 |
| ·主要仪器设备 | 第23-24页 |
| ·主要试剂及药品 | 第24-25页 |
| ·主要试剂 | 第24页 |
| ·培养细胞所用试剂 | 第24页 |
| ·Western bolt主要试剂 | 第24-25页 |
| ·常用试剂的配制 | 第25-27页 |
| ·转化所用溶液的配制 | 第25页 |
| ·细胞培养所用试剂 | 第25-26页 |
| ·用于SDS-PAGE缓冲液的配制 | 第26-27页 |
| ·其他常用试剂配制 | 第27页 |
| ·主要应用到的生物信息学网站和分析软件 | 第27页 |
| 2 试验方法 | 第27-50页 |
| ·生物信息学预测SMG5调控相关的miRNAs | 第27-28页 |
| ·mRNA和miRNA组织表达谱的检测 | 第28-35页 |
| ·mRNA组织表达谱的检测 | 第28-31页 |
| ·miRNA组织表达谱的检测 | 第31-35页 |
| ·双荧光素酶报告载体的构建 | 第35-41页 |
| ·野生型双荧光素酶报告载体的构建 | 第35-40页 |
| ·突变型双荧光素酶报告载体的构建 | 第40-41页 |
| ·细胞培养与转染 | 第41-44页 |
| ·细胞培养和传代 | 第41-42页 |
| ·细胞冻存 | 第42页 |
| ·细胞复苏 | 第42页 |
| ·HEK-293T细胞转染 | 第42-43页 |
| ·Hela细胞的转染 | 第43-44页 |
| ·双荧光素酶报告基因的检测 | 第44页 |
| ·miRNA的超表达和抑制表达 | 第44-46页 |
| ·miR-433 mimic瞬时转染转染BHK和C2C12细胞 | 第44页 |
| ·转染效率估测 | 第44-45页 |
| ·转染后miRNA和mRNA的检测 | 第45-46页 |
| ·western boltting检测靶基因的水平 | 第46-48页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第46页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第46-47页 |
| ·Western blot具体步骤 | 第47-48页 |
| ·干扰SMG5对NMD底物基因的影响 | 第48-50页 |
| ·siRNA转染的主要试剂及仪器 | 第48-49页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第49页 |
| ·cDNA的合成 | 第49页 |
| ·实时定量PCR检测底物基因的mRNA变化 | 第49页 |
| ·Western bolt检测底物基因蛋白的变化 | 第49-50页 |
| 第三章 结果分析 | 第50-65页 |
| 1 作用于SMG5的miRNA的预测 | 第50页 |
| 2 mRNA和miRNA的组织表达谱分析 | 第50-54页 |
| ·组织总RNA的质量检测 | 第50-51页 |
| ·cDNA结果检测 | 第51-52页 |
| ·mRNA的cDNA检测结果 | 第51页 |
| ·miR-433的cDNA的检测结果及成熟序列的扩增 | 第51-52页 |
| ·SMG5在小鼠各个组织中的表达谱分析结果 | 第52-53页 |
| ·miRNA在小鼠各组织中的表达谱分析结果 | 第53-54页 |
| 3 双荧光素酶报告载体的构建与鉴定结果 | 第54-57页 |
| ·野生型双荧光素酶报告载体的构建 | 第54-55页 |
| ·SMG53’UTR序列的扩增 | 第54页 |
| ·pmirGLO-SMG5-WT重组质粒的构建 | 第54-55页 |
| ·突变型双荧光素酶报告载体的构建 | 第55-56页 |
| ·重组质粒的碱基突变 | 第55-56页 |
| ·双荧光素酶报告基因的检测结果 | 第56-57页 |
| 4 miR-433超表达和抑制表达试验结果 | 第57-61页 |
| ·荧光显微镜下mimic转染效率检测 | 第57-58页 |
| ·实时定量PCR检测miR-433的超表达和抑制表达结果 | 第58-59页 |
| ·荧光定量PCR检测miR-433对SMG5的调控 | 第59-60页 |
| ·SMG5的Western blotting检测结果 | 第60-61页 |
| 5 NMD底物基因调控研究结果 | 第61-65页 |
| ·实时荧光定量PCR检测下游基因的表达 | 第61-62页 |
| ·底物基因的Western blotting检测结果 | 第62页 |
| ·干扰SMG5基因对底物基因表达的影响 | 第62-65页 |
| ·干扰SGM5后导致底物基因mRNA水平上升 | 第62-63页 |
| ·干扰SMG5后底物蛋白表达水平升高 | 第63-65页 |
| 第四章 讨论 | 第65-70页 |
| 1 miRNA-433功能和作用的靶基因 | 第65页 |
| 2 SMG5在NMD通路的作用 | 第65-66页 |
| 3 miRNA-433通过调控SMG5来参与NMD通路及其意义 | 第66-67页 |
| 4 关于本研究涉及到的实验技术和方法的讨论 | 第67-70页 |
| ·关于实时荧光定量PCR | 第67-68页 |
| ·关于Western bolt | 第68-70页 |
| 第五章 小结 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-80页 |
| 附录 | 第80-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
