| 目录 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-15页 |
| 縮略词 | 第15-16页 |
| 文献综述 | 第16-29页 |
| 第一章 谷氨酸棒杆菌中一种新的草酰乙酸脱羧酶Cg1458基因的克隆表达,蛋白纯化及生化特性鉴定 | 第29-39页 |
| ·实验材料 | 第29-30页 |
| ·质粒及宿主菌 | 第29页 |
| ·引物 | 第29页 |
| ·谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032菌株 | 第29页 |
| ·酶和试剂 | 第29-30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| ·实验方法 | 第30-33页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因及扩增产物的纯化 | 第30-31页 |
| ·表达载体的构建 | 第31页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 | 第31-32页 |
| ·草酰乙酸脱羧酶酶活力测定 | 第32页 |
| ·pH值对酶活力的影响 | 第32-33页 |
| ·金属离子对酶活力的影响 | 第33页 |
| ·草酸对酶活力的影响 | 第33页 |
| ·结果与分析 | 第33-37页 |
| ·目的基因的扩增 | 第33-34页 |
| ·表达载体的构建 | 第34页 |
| ·Cg1458在大肠杆菌中的诱导表达 | 第34页 |
| ·Cg1458表达条件的优化 | 第34-35页 |
| ·Cg1458的初步纯化 | 第35-36页 |
| ·pH对酶活力的影响 | 第36页 |
| ·金属离子对酶活力的影响 | 第36-37页 |
| ·抑制剂对酶活力的影响 | 第37页 |
| ·讨论 | 第37-39页 |
| 第二章 Cg1458的晶体结构及催化机制的解析 | 第39-69页 |
| ·实验材料 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39页 |
| ·主要仪器 | 第39页 |
| ·实验方法 | 第39-42页 |
| ·Cg1458蛋白凝胶过滤 | 第39页 |
| ·晶体生长 | 第39-40页 |
| ·X-射线晶体衍射及数据处理 | 第40页 |
| ·Cg1458晶体结构解析 | 第40页 |
| ·Cg1458活性中心位点的鉴定 | 第40-42页 |
| ·TTHA0809野生型及His60及Glu73突变体活性的测定 | 第42页 |
| ·实验结果 | 第42-58页 |
| ·Cg1458过Superdex G-200凝胶过滤结果 | 第42-43页 |
| ·Cg1458晶体及衍射结果 | 第43-44页 |
| ·Cg1458与草酸复合体晶体及衍射结果 | 第44页 |
| ·Cg1458结构解析 | 第44-49页 |
| ·Cg1458突变体表达载体的构建 | 第49-50页 |
| ·Cg1458突变体蛋白的纯化 | 第50-55页 |
| ·Cg1458突变体蛋白酶活力测定结果 | 第55-56页 |
| ·TTHA0809野生型及突变体蛋白表达载体构建 | 第56-57页 |
| ·TTHA0809野生型及突变体蛋白的纯化及活力测定 | 第57-58页 |
| ·讨论 | 第58-69页 |
| 第三章 霍乱弧菌草酰乙酸脱羧酶的研究 | 第69-83页 |
| 引言 | 第69-70页 |
| ·实验材料 | 第70-71页 |
| ·酶及分子生物学用品等 | 第70页 |
| ·引物 | 第70-71页 |
| ·实验方法 | 第71页 |
| ·表达载体的构建及重组蛋白的表达 | 第71页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第71页 |
| ·实验结果 | 第71-82页 |
| ·S.marinus F1菌株中草酰乙酸脱羧酶的克隆及表达 | 第71-73页 |
| ·VcOad β亚基的克隆表达 | 第73-74页 |
| ·VcOad beta亚基分别与α或γ亚基融合表达 | 第74-76页 |
| ·在VcOad_2 beta亚基的不同位置引入his-tag | 第76-82页 |
| ·讨论 | 第82-83页 |
| 第四章 极端嗜热菌中TTHA1296蛋白水解酶的研究 | 第83-97页 |
| 引言 | 第83页 |
| ·实验材料 | 第83页 |
| ·实验方法 | 第83-86页 |
| ·TTHA1296蛋白酶,Oad454及底物蛋白Oad525的纯化 | 第83-84页 |
| ·TTHA1296蛋白酶活力测定 | 第84页 |
| ·pH值对TTHA1296蛋白酶活力的影响 | 第84页 |
| ·温度对TTHA1296蛋白酶稳定性及活力的影响 | 第84页 |
| ·金属离子对TTHA1296蛋白酶活力的影响 | 第84页 |
| ·蛋白酶抑制剂对TTHA1296蛋白酶活力的影响 | 第84-85页 |
| ·表面活性剂对TTHA1296蛋白酶活力的影响 | 第85页 |
| ·TTHA1296结晶条件筛选 | 第85-86页 |
| ·实验结果 | 第86-94页 |
| ·TTHA1296蛋白酶切割底物的C末端 | 第86页 |
| ·pH值对TTHA1296蛋白酶活力的影响 | 第86页 |
| ·温度对TTHA1296蛋白酶活力的影响 | 第86-88页 |
| ·金属离子对TTHA1296蛋白酶活力的影响 | 第88-89页 |
| ·蛋白酶抑制剂对TTHA1296蛋白酶活力的影响 | 第89页 |
| ·表面活性剂对TTHA1296蛋白酶活力的影响 | 第89-90页 |
| ·TTHA1296结晶条件筛选及晶体衍射结果 | 第90-92页 |
| ·TTHA1296与Oad525复合体结晶条件筛选及晶体衍射结果 | 第92-93页 |
| ·TTHA1296与小肽复合体结晶条件筛选及晶体衍射结果 | 第93-94页 |
| ·TTHA1296及复合体晶体衍射数据处理结果 | 第94页 |
| ·讨论 | 第94-97页 |
| 全文总结 | 第97-98页 |
| 博士论文创新点 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-104页 |
| 附录 | 第104-111页 |
| 1 常用缓冲液系统 | 第104-107页 |
| ·SDS-PAGE电泳缓冲液 | 第104页 |
| ·蛋白纯化缓冲液 | 第104-105页 |
| ·质粒提取和电泳相关溶液 | 第105-106页 |
| ·酶反应体系缓冲液 | 第106-107页 |
| 2 DNA操作 | 第107-108页 |
| ·质粒DNA的制备(碱裂解法提取质粒) | 第107页 |
| ·限制性内切酶反应 | 第107页 |
| ·DNA片段的回收 | 第107-108页 |
| ·连接反应 | 第108页 |
| 3 转化 | 第108-109页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第108页 |
| ·质粒DNA及连接产物的转化 | 第108-109页 |
| 4 重叠PCR法进行氨基酸突变 | 第109页 |
| 5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第109-111页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳制胶配方 | 第109页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶的灌制 | 第109页 |
| ·样品制备及电泳 | 第109-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第112页 |
