| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-8页 |
| 1 绪论 | 第8-17页 |
| ·引言 | 第8-10页 |
| ·EIN3 简述 | 第10-11页 |
| ·重组蛋白表达体系 | 第11-12页 |
| ·研究意义及创新点 | 第12页 |
| ·研究内容及技术路线 | 第12-17页 |
| ·原核表达工程菌构建 | 第12-13页 |
| ·pPIC9k-EIN3 重组质粒构建 | 第13-14页 |
| ·酵母表达工程菌的筛选以及表达鉴定 | 第14-15页 |
| ·重组蛋白质的纯化及鉴定 | 第15-17页 |
| 2 实验仪器及试剂 | 第17-19页 |
| ·实验仪器及器材 | 第17页 |
| ·实验材料及试剂 | 第17-19页 |
| 3 实验方法 | 第19-36页 |
| ·原核表达工程菌的构建及表达鉴定 | 第19-27页 |
| ·PCR 扩增番茄EIN3 目的基因 | 第19-20页 |
| ·pET15b-EIN3 及pET30a-EIN3 载体的构建 | 第20-21页 |
| ·扩增的番茄EIN3 基因和载体的酶切 | 第21-22页 |
| ·番茄EIN3 与载体的连接 | 第22页 |
| ·氯化钙法制备大肠杆菌BL21 感受态细胞 | 第22-23页 |
| ·大肠杆菌BL21 的转化 | 第23-24页 |
| ·阳性转化子的PCR 检测 | 第24页 |
| ·重组质粒的测序 | 第24页 |
| ·重组菌株的保存 | 第24页 |
| ·原核表达工程菌的诱导表达 | 第24-25页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测诱导表达结果 | 第25-26页 |
| ·ELISA 酶联免疫鉴定目的蛋白 | 第26-27页 |
| ·构建重组PPIC9K-EIN3 表达质粒 | 第27-29页 |
| ·PCR 扩增番茄EIN3 目的基因 | 第27-28页 |
| ·载体pPIC9k 的制备 | 第28页 |
| ·番茄EIN3 基因和pPIC9k 载体的酶切 | 第28页 |
| ·番茄EIN3 与pPIC9k 载体的连接 | 第28页 |
| ·阳性转化子的PCR 检测 | 第28-29页 |
| ·双酶切鉴定 | 第29页 |
| ·重组外源基因在毕赤酵母（PICHIA PASTORIS）中的转化、鉴定和筛选 | 第29-32页 |
| ·pPIC9k-EIN3 重组质粒的线性化 | 第29-30页 |
| ·酵母KM71 感受态制备 | 第30页 |
| ·电穿孔法将外源基因导入酵母细胞 | 第30-31页 |
| ·PCR 快速鉴定转化子 | 第31-32页 |
| ·G418 法筛选多拷贝插入的转化子 | 第32页 |
| ·真核表达重组蛋白的表达及鉴定 | 第32-33页 |
| ·转化子的扩增和诱导表达 | 第32页 |
| ·重组蛋白质的表达鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组蛋白质的纯化 | 第33-36页 |
| ·诱导表达产物的预处理 | 第33页 |
| ·亲和层析纯化重组蛋白质 | 第33-34页 |
| ·纯化蛋白质的浓缩 | 第34-36页 |
| 4 结果与分析 | 第36-46页 |
| ·目的基因的PCR 扩增 | 第36页 |
| ·pET15b/BL21 及 pET30a/BL21 工程菌的构建 | 第36-38页 |
| ·PCR 鉴定重组载体 | 第36-37页 |
| ·双酶切检测阳性克隆 | 第37-38页 |
| ·重组质粒序列测定及比较鉴定 | 第38页 |
| ·pPIC9k-EIN3 重组质粒的构建及鉴定 | 第38-40页 |
| ·构建前酶切效果电泳检测 | 第38-39页 |
| ·重组载体PCR 快速检测 | 第39页 |
| ·双酶切检测阳性克隆 | 第39-40页 |
| ·重组质粒序列测定及比较鉴定 | 第40页 |
| ·pPIC9k-EIN3/KM71 克隆子鉴定 | 第40-41页 |
| ·PCR 快速鉴定模板制备 | 第40-41页 |
| ·PCR 快速鉴定阳性克隆 | 第41页 |
| ·多拷贝数插入转化子的筛选 | 第41页 |
| ·大肠杆菌工程菌蛋白表达鉴定 | 第41-43页 |
| ·两种原核表达工程菌表达产物的SDS-PAGE 电泳分析 | 第41-42页 |
| ·两种原核表达工程菌表达产物的ELISA 鉴定 | 第42-43页 |
| ·酵母工程菌蛋白表达鉴定 | 第43-44页 |
| ·诱导培养后SDS-PAGE 检测目的蛋白质 | 第43页 |
| ·ELISA 鉴定目的蛋白的诱导表达 | 第43-44页 |
| ·蛋白纯化鉴定 | 第44-46页 |
| ·洗脱条件优化 | 第44-45页 |
| ·纯化蛋白质SDS-PAGE 电泳检测 | 第45页 |
| ·纯化蛋白ELISA 鉴定 | 第45-46页 |
| 5 讨论 | 第46-51页 |
| ·不同表达系统表达番茄EIN3 蛋白质的优缺点 | 第46-48页 |
| ·重组质粒的构建结果分析 | 第48页 |
| ·酵母细胞转化和高拷贝表达转化子的筛选分析 | 第48-49页 |
| ·目的基因在酵母细胞中的表达及纯化分析 | 第49-51页 |
| 6 小结 | 第51-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-55页 |
