| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-44页 |
| 一．TRAIL的研究进展 | 第14-30页 |
| 1．TRAIL及其受体的发现 | 第15页 |
| 2．TRAIL的分子结构 | 第15-16页 |
| 3．TRAIL的受体 | 第16-19页 |
| 3．1 TRAIL-R1 | 第17-18页 |
| 3．2 TRAIL-R2 | 第18页 |
| 3．3 TRAIL-R3 | 第18-19页 |
| 3．4 TRAIL-R4 | 第19页 |
| 3．5 OPG | 第19页 |
| 4．TRAIL和受体之间的相互作用 | 第19-20页 |
| 5．TRAIL诱导凋亡的机制 | 第20-22页 |
| 6．机体对TRAIL和TRAILR的表达调控 | 第22-23页 |
| 7．与TRAIL凋亡有关的分子 | 第23-24页 |
| 8．TRAIL-DR激活的其他信号通路 | 第24-25页 |
| 8．1 NFκB信号通路 | 第24页 |
| 8．2 PI3激酶—AKt信号通路 | 第24-25页 |
| 8．3 JNK信号通路 | 第25页 |
| 9．TRAIL诱导细胞凋亡影响因素 | 第25-26页 |
| 10．TRAIL在肿瘤治疗中的应用 | 第26-30页 |
| 10．1 TRAIL在肿瘤治疗中的研究现状 | 第27-28页 |
| 10．2 增强癌细胞对TRAIL敏感性的策略 | 第28-30页 |
| 10．2．1 离子射线的作用 | 第28页 |
| 10．2．2 抗真菌药的作用 | 第28页 |
| 10．2．3 化疗药的作用 | 第28-29页 |
| 10．2．4 基因毒性药物的作用 | 第29页 |
| 10．2．5 细胞因子的作用 | 第29页 |
| 10．2．6 过氧化物酶增生物激活受体—γ的作用 | 第29-30页 |
| 二．大肠杆菌表达系统 | 第30-36页 |
| 1 表达宿主概述 | 第30-31页 |
| 2 表达载体pET系统概述 | 第31-36页 |
| 2．1 选择pET载体 | 第31-34页 |
| 2．2 表达菌株的选择 | 第34-36页 |
| 三．巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第36-44页 |
| 1 巴斯德毕赤酵母的生物学 | 第36-37页 |
| 2 巴斯德毕赤酵母表达载体 | 第37-39页 |
| 3 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的外部条件 | 第39-44页 |
| 3．1 外源基因特性 | 第39页 |
| 3．2 启动子的选择 | 第39-40页 |
| 3．3 mRNA的非翻译区(UTR) | 第40页 |
| 3．4 起始密码子AUG的旁侧序列 | 第40页 |
| 3．5 表达框的染色体整合位点和方式 | 第40页 |
| 3．6 宿主菌的甲醇利用表型(Mut~+和Mut~s) | 第40-41页 |
| 3．7 基因剂量 | 第41-42页 |
| 3．8 分泌信号 | 第42页 |
| 3．9 产物稳定性 | 第42页 |
| 3．10 翻译后修饰 | 第42-43页 |
| 3．11 发酵条件 | 第43-44页 |
| 第二章 材料和方法 | 第44-65页 |
| 一．原核表达 | 第44-59页 |
| 2．1 材料 | 第44-48页 |
| 2．1．1 质粒和菌株 | 第44页 |
| 2．1．2 细菌和细胞培养所用溶液 | 第44页 |
| 2．1．3 提取总RNA所用的试剂与溶液 | 第44-45页 |
| 2．1．4 RT和PCR反应所用的试剂与溶液 | 第45页 |
| 2．1．5 PCR产物的回收，连接，鉴定所用的试剂与溶液 | 第45页 |
| 2．1．6 蛋白纯化，鉴定所用的试剂与溶液 | 第45-47页 |
| 2．1．7 Western-blot所用的试剂与溶液 | 第47-48页 |
| 2．2 方法 | 第48-59页 |
| 2．2．1 总RNA提取和第一链cDNA的合成 | 第48页 |
| 2．2．2 引物的合成和PCR反应 | 第48-49页 |
| 2．2．3 PCR产物回收与T载体法的连接和转化 | 第49-53页 |
| 2．2．3．1 PCR产物回收 | 第49-50页 |
| 2．2．3．2 T载体的连接 | 第50-51页 |
| 2．2．3．3 感受态细胞的制备 | 第51页 |
| 2．2．3．4 转化 | 第51-52页 |
| 2．2．3．5 碱裂解发提取质粒结果鉴定 | 第52-53页 |
| 2．2．3．5．1 收获 | 第52页 |
| 2．2．3．5．2 碱裂解法 | 第52-53页 |
| 2．2．3．5．3 酶切鉴定 | 第53页 |
| 2．2．4 重组子的筛选和鉴定 | 第53页 |
| 2．2．4．1 pET30a的酶切 | 第53页 |
| 2．2．4．2 重组子的构建和鉴定 | 第53页 |
| 2．2．5 重组蛋白的表达和纯化 | 第53-56页 |
| 2．2．5．1 重组蛋白的诱导表达 | 第53-54页 |
| 2．2．5．2 菌体的收获和破碎 | 第54页 |
| 2．2．5．3 蛋白的纯化 | 第54页 |
| 2．2．5．4 Western blotting | 第54-56页 |
| 2．2．6 蛋白定量 | 第56页 |
| 2．2．7 细胞培养 | 第56-57页 |
| 2．2．8 MTT试验 | 第57页 |
| 2．2．8．1 实验原理 | 第57页 |
| 2．2．8．2 实验步骤 | 第57页 |
| 2．2．9 PI／Hoechest33258染色检测凋亡细胞 | 第57-58页 |
| 2．2．9．1 实验原理 | 第57-58页 |
| 2．2．9．2 实验步骤 | 第58页 |
| 2．2．10 计算机模拟 | 第58-59页 |
| 二．毕赤酵母表达 | 第59-65页 |
| 2．1 表达载体的构建 | 第59页 |
| 2．1．1 质粒和菌株 | 第59页 |
| 2．1．2 PCR引物 | 第59页 |
| 2．1．3 载体构建 | 第59页 |
| 2．2 酵母转化 | 第59-61页 |
| 2．2．1 溶液 | 第59-60页 |
| 2．2．2 方法 | 第60-61页 |
| 2．3 筛选 | 第61-62页 |
| 2．3．1 筛选多基因整合转化子 | 第61页 |
| 2．3．2 筛选Mut~+或Mut~s转化子 | 第61-62页 |
| 2．4 PCR鉴定整合 | 第62-64页 |
| 2．4．1 分离酵母DNA | 第62-63页 |
| 2．4．2 PCR分析 | 第63-64页 |
| 2．5 诱导表达 | 第64-65页 |
| 第三章 实验结果和讨论 | 第65-78页 |
| 3．1 原核表达 | 第65-72页 |
| 3．1．1 PCR | 第65-66页 |
| 3．1．2 重组质粒的构建 | 第66-67页 |
| 3．1．3 重组蛋白的表达 | 第67-69页 |
| 3．1．4 重组蛋白的纯化 | 第69页 |
| 3．1．5 Western-blotting | 第69页 |
| 3．1．6 重组TRAIL蛋白A，B可抑制肿瘤细胞增殖 | 第69-70页 |
| 3．1．7 蛋白B可抑制不同的肿瘤细胞增殖 | 第70-71页 |
| 3．1．8 计算机模拟 | 第71-72页 |
| 3．2 酵母表达 | 第72-75页 |
| 3．2．1 PCR | 第72-74页 |
| 3．2．2 重组子的构建 | 第74页 |
| 3．2．3 酵母表达 | 第74-75页 |
| 3．3 讨论 | 第75-78页 |
| 研究总结 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-88页 |
| 附录 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89页 |
