| 英文缩略词 | 第1-11页 |
| 摘要 | 第11-14页 |
| ABSTRACT | 第14-17页 |
| 1 前言 | 第17-30页 |
| ·精氨酸激酶的生物学功能 | 第17-18页 |
| ·精氨酸激酶的分子生物学 | 第18-20页 |
| ·精氨酸激酶表达调控研究 | 第20-21页 |
| ·精氨酸激酶底物结合的协同作用 | 第21-22页 |
| ·精氨酸激酶的折叠和去折叠 | 第22-27页 |
| ·蛋白质折叠的主要假说和模型 | 第22-25页 |
| ·框架模型 | 第22-23页 |
| ·疏水塌缩模型 | 第23页 |
| ·扩散-碰撞-粘合机制 | 第23-24页 |
| ·成核-凝聚-生长模型 | 第24-25页 |
| ·蛋白质的体外折叠 | 第25-26页 |
| ·蛋白质去折叠的研究 | 第26-27页 |
| ·精氨酸激酶的晶体结构和空间结构模拟 | 第27-29页 |
| ·精氨酸激酶的晶体结构 | 第27-29页 |
| ·精氨酸激酶的空间结构模拟 | 第29页 |
| ·本研究的科学意义 | 第29-30页 |
| 2 材料与方法 | 第30-54页 |
| ·实验材料 | 第30-31页 |
| ·生物材料 | 第30页 |
| ·菌株与质粒 | 第30页 |
| ·酶及生化试剂 | 第30页 |
| ·PCR 引物 | 第30-31页 |
| ·实验方法 | 第31-41页 |
| ·总RNA 的提取 | 第31-32页 |
| ·cDNA 第一条链的合成 | 第32页 |
| ·cDNA 纯化 | 第32-33页 |
| ·对cDNA 进行末端加尾 | 第33页 |
| ·精氨酸激酶基因全长的克隆 | 第33-37页 |
| ·中间片段的获得 | 第33-34页 |
| ·通过5’RACE 获得5’端序列 | 第34-35页 |
| ·通过3’RACE 获得3’端序列 | 第35-36页 |
| ·精氨酸激酶基因全长的克隆 | 第36-37页 |
| ·精氨酸激酶的原核表达 | 第37-41页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第37页 |
| ·连接 | 第37页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第37-38页 |
| ·转化及克隆筛选 | 第38页 |
| ·碱法小量提取质粒DNA | 第38-39页 |
| ·质粒DNA 的酶切鉴定 | 第39页 |
| ·回收 | 第39页 |
| ·DNA 序列测定 | 第39页 |
| ·E.coli BL21 的原核表达 | 第39-40页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第40-41页 |
| ·原核表达精氨酸激酶的纯化 | 第41-46页 |
| ·蛋白质含量的测定 | 第41页 |
| ·酶活力测定方法 | 第41页 |
| ·原核表达活性AK 的纯化 | 第41-42页 |
| ·粗酶液的制备 | 第41-42页 |
| ·分子筛层析和离子交换层析纯化 | 第42页 |
| ·亲和层析方法纯化原核表达活性AK | 第42页 |
| ·4 原核表达包涵体AK 的纯化及复性 | 第42-46页 |
| ·精氨酸激酶纯度的鉴定及分子量的测定 | 第43页 |
| ·抗体的制备 | 第43-44页 |
| ·抗血清效价的测定 | 第44页 |
| ·Western 杂交 | 第44-46页 |
| ·精氨酸激酶关键位点的定点突变 | 第46-47页 |
| ·突变精氨酸激酶的原核表达和分离纯化 | 第47页 |
| ·精氨酸激酶的酶学性质的研究 | 第47-49页 |
| ·精氨酸激酶的动力学特性 | 第47-48页 |
| ·酶浓度对酶促反应速率的影响 | 第47-48页 |
| ·米氏常数Km 及其它动力学参数的测定 | 第48页 |
| ·酶反应最适pH 的测定 | 第48页 |
| ·酶最适温度的测定 | 第48页 |
| ·精氨酸激酶等电点及荧光发射光谱测定 | 第48-49页 |
| ·精氨酸激酶外源荧光光谱测定 | 第49页 |
| ·精氨酸激酶的热变性和热聚沉 | 第49页 |
| ·盐酸胍诱导的精氨酸激酶的失活 | 第49页 |
| ·盐酸胍浓度依赖的精氨酸激酶的折叠和去折叠 | 第49-50页 |
| ·精氨酸激酶折叠和去折叠材料的处理 | 第49-50页 |
| ·精氨酸激酶折叠和去折叠的光谱学试验 | 第50页 |
| ·参数A 和相图法对AK 光谱学的数据分析 | 第50页 |
| ·精氨酸激酶表达调控模式研究 | 第50-54页 |
| ·精氨酸激酶启动子的获得 | 第50页 |
| ·精氨酸激酶表达调控模式研究 | 第50页 |
| ·Northern 杂交分析 | 第50-54页 |
| ·总RNA 的提取 | 第51页 |
| ·甲醛变性胶电泳 | 第51-52页 |
| ·转膜 | 第52页 |
| ·预杂交 | 第52-53页 |
| ·探针的制备 | 第53页 |
| ·杂交 | 第53页 |
| ·洗膜 | 第53页 |
| ·放射自显影 | 第53-54页 |
| 3. 结果与分析 | 第54-85页 |
| ·精氨酸激酶基因的克隆及表达分析 | 第54-61页 |
| ·精氨酸激酶基因的克隆 | 第54-55页 |
| ·精氨酸激酶基因的序列分析 | 第55-60页 |
| ·精氨酸激酶原核表达、纯化及酶学性质研究 | 第60-61页 |
| ·原核表达载体pET-AK 的构建 | 第60页 |
| ·SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第60页 |
| ·AK 的分离纯化结果 | 第60-61页 |
| ·原核表达精氨酸激酶酶学性质研究 | 第61-69页 |
| ·原核表达精氨酸激酶等电点及荧光发射光谱测定 | 第61-62页 |
| ·原核表达精氨酸激酶的动力学特征 | 第62-69页 |
| ·酶浓度对酶促反应速率的影响 | 第62-64页 |
| ·原核表达精氨酸激酶的Km~(Arg) 和Km~(ATP) | 第64-65页 |
| ·原核表达精氨酸激酶的动力学参数 | 第65-67页 |
| ·原核表达精氨酸激酶最适反应pH | 第67页 |
| ·原核表达精氨酸激酶最适反应温度 | 第67-68页 |
| ·精氨酸激酶的包涵体复性 | 第68-69页 |
| ·精氨酸激酶的定点突变、原核表达、纯化及酶学性质研究 | 第69-85页 |
| ·精氨酸激酶的定点突变、原核表达和纯化 | 第69-70页 |
| ·精氨酸激酶底物结合协同性有关的氨基酸位点的研究 | 第70-82页 |
| ·突变酶的动力学 | 第70-71页 |
| ·突变酶的内源荧光光谱学变化 | 第71-74页 |
| ·突变酶的空间结构的模拟 | 第74-75页 |
| ·突变酶的ANS 光谱 | 第75-76页 |
| ·突变对精氨酸激酶的热稳定性和热聚沉的影响 | 第76-77页 |
| ·突变对盐酸胍诱导的精氨酸激酶失活的影响 | 第77-78页 |
| ·突变对精氨酸激酶的去折叠和再折叠的影响 | 第78-81页 |
| ·突变酶的动力学和稳定性参数 | 第81-82页 |
| ·271 位半胱氨酸突变对精氨酸激酶的影响 | 第82页 |
| ·精氨酸激酶基因的表达调控分析 | 第82-85页 |
| ·RT-PCR 和酶活性分析 | 第82页 |
| ·精氨酸激酶表达模式分析 | 第82-84页 |
| ·精氨酸激酶基因的启动子和上游元件分析 | 第84-85页 |
| 4 讨论 | 第85-93页 |
| ·精氨酸激酶的基因序列分析 | 第85-86页 |
| ·精氨酸激酶的原核表达和纯化 | 第86-88页 |
| ·突变对底物结合协同性的影响及其作用机制 | 第88-90页 |
| ·突变对酶空间结构、稳定性的影响及其作用机制 | 第90-91页 |
| ·精氨酸激酶的表达调控研究 | 第91-92页 |
| ·进一步研究方向 | 第92-93页 |
| 5 结论 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-110页 |
| 致谢 | 第110-111页 |
| 攻读硕士学位期间发表的和待发表的论文 | 第111页 |