| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7页 |
| 英文缩略表 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-19页 |
| 1.1 球虫及球虫病 | 第12页 |
| 1.2 顶复门原虫穿孔素蛋白 | 第12-15页 |
| 1.2.1 弓形虫 | 第13-14页 |
| 1.2.2 疟原虫 | 第14-15页 |
| 1.3 穿孔素、颗粒酶及颗粒溶素杀伤靶细胞的作用机制 | 第15-17页 |
| 1.4 原虫感染与穿孔素、颗粒酶及颗粒溶素 | 第17-18页 |
| 1.5 小结 | 第18-19页 |
| 第二章 EtPLPs基因的克隆表达与亚细胞定位 | 第19-31页 |
| 2.1 材料与方法 | 第19-24页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第19页 |
| 2.1.2 虫株、菌株与载体 | 第19页 |
| 2.1.3 主要实验试剂 | 第19页 |
| 2.1.4 E.tenella子孢子和裂殖子的收集与纯化 | 第19-20页 |
| 2.1.5 E.tenella子孢子和裂殖子总RNA的提取与反转录 | 第20-21页 |
| 2.1.6 序列分析与引物设计 | 第21页 |
| 2.1.7 EtPLPs基因的RT-PCR扩增与克隆 | 第21页 |
| 2.1.8 EtPLPs基因的序列分析 | 第21-22页 |
| 2.1.9 EtPLPs的原核表达 | 第22页 |
| 2.1.10 小鼠多克隆抗体的制备 | 第22-23页 |
| 2.1.11 多克隆抗体的鉴定 | 第23页 |
| 2.1.12 免疫荧光检测 | 第23-24页 |
| 2.2 实验结果与分析 | 第24-29页 |
| 2.2.1 EtPLPs基因的扩增 | 第24-25页 |
| 2.2.2 EtPLPs生物信息学分析 | 第25-26页 |
| 2.2.3 重组质粒的鉴定 | 第26-27页 |
| 2.2.4 重组蛋白的诱导表达 | 第27页 |
| 2.2.5 多克隆抗体的制备 | 第27-28页 |
| 2.2.6 Western blot分析 | 第28-29页 |
| 2.2.7 免疫荧光分析 | 第29页 |
| 2.3 讨论 | 第29-31页 |
| 2.3.1 基因序列分析 | 第29-30页 |
| 2.3.2 穿孔素样蛋白结构域分析 | 第30-31页 |
| 第三章 E.tenella不同发育阶段EtPLPs基因转录的变化 | 第31-40页 |
| 3.1 实验材料与方法 | 第31-34页 |
| 3.1.1 实验动物 | 第31页 |
| 3.1.2 虫株 | 第31页 |
| 3.1.3 主要实验试剂 | 第31页 |
| 3.1.4 主要实验仪器与设备 | 第31页 |
| 3.1.5 卵囊纯化以及子孢子、裂殖子收集纯化试剂 | 第31-32页 |
| 3.1.6 引物设计 | 第32页 |
| 3.1.7 E.tenella子孢子、第一代裂殖子、第二代裂殖子、未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊收集 | 第32-33页 |
| 3.1.8 E.tenella各阶段虫株总RNA的提取 | 第33页 |
| 3.1.9 第一链cDNA合成 | 第33页 |
| 3.1.10 目的基因和参照基因引物浓度确定 | 第33页 |
| 3.1.11 目的基因和参照基因标准曲线的建立 | 第33-34页 |
| 3.1.12 qRT-PCR检测E.tenella各个阶段EtPLP1、EtPLP2基因转录水平 | 第34页 |
| 3.1.13 各阶段EtPLP1、EtPLP2基因转录水平分析 | 第34页 |
| 3.2 结果与分析 | 第34-38页 |
| 3.2.1 各实验组总RNA抽提结果 | 第34-35页 |
| 3.2.2 cDNA模板质量 | 第35页 |
| 3.2.3 引物浓度确定结果 | 第35-36页 |
| 3.2.4 目的基因和参照基因扩增效率、标准曲线和融解曲线的建立 | 第36-37页 |
| 3.2.5 待测样品目的基因和参照基因qRT-PCR结果 | 第37页 |
| 3.2.6 E.tenella广东株各阶段EtPLP1和EtPLP2 mRNA水平 | 第37-38页 |
| 3.3 讨论 | 第38-40页 |
| 第四章 球虫感染后肠道穿孔素、颗粒酶A及颗粒溶素转录动态分析 | 第40-47页 |
| 4.1 实验材料与方法 | 第40-42页 |
| 4.1.1 实验动物 | 第40页 |
| 4.1.2 虫株 | 第40页 |
| 4.1.3 主要实验试剂 | 第40页 |
| 4.1.4 主要实验仪器与设备 | 第40页 |
| 4.1.5 实验分组 | 第40-41页 |
| 4.1.6 小肠和盲肠组织总RNA的提取及cDNA的合成 | 第41页 |
| 4.1.7 引物设计 | 第41-42页 |
| 4.1.8 标准曲线建立 | 第42页 |
| 4.1.9 球虫感染后鸡肠道三种基因表达水平 | 第42页 |
| 4.1.10 目的基因相对表达量的计算 | 第42页 |
| 4.2 实验结果与分析 | 第42-45页 |
| 4.2.1 总RNA提取结果 | 第42-43页 |
| 4.2.2 标准曲线的建立 | 第43-44页 |
| 4.2.3 球虫感染后鸡肠道穿孔素与颗粒溶素mRNA表达差异分析 | 第44-45页 |
| 4.3 讨论 | 第45-47页 |
| 4.3.1 实时荧光定量PCR方法的选择 | 第45-46页 |
| 4.3.2 穿孔素与颗粒溶素mRNA表达差异分析 | 第46-47页 |
| 第五章 全文结论 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-55页 |
| 附录 | 第55-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
| 作者简历 | 第61页 |
