| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略表 | 第14-16页 |
| 第一章 引言 | 第16-23页 |
| 1.1 弓形虫简述 | 第16-17页 |
| 1.1.1 弓形虫的流行病学 | 第16页 |
| 1.1.2 弓形虫的分类及生活史 | 第16-17页 |
| 1.1.3 弓形虫的危害 | 第17页 |
| 1.2 弓形虫与宿主间相互作用关系简述 | 第17-20页 |
| 1.2.1 弓形虫入侵机制 | 第17-18页 |
| 1.2.2 宿主清除弓形虫的天然免疫系统 | 第18-19页 |
| 1.2.3 弓形虫抵抗宿主免疫清除的重要因子 | 第19-20页 |
| 1.3 CRISPR/CAS9 系统简述 | 第20-21页 |
| 1.4 本研究的意义 | 第21-23页 |
| 第二章 弓形虫ROP18 蛋白表达及多克隆抗体的制备 | 第23-34页 |
| 2.1 材料 | 第23-26页 |
| 2.1.1 实验动物、虫株与载体 | 第23页 |
| 2.1.2 实验试剂及主要耗材 | 第23-24页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第24页 |
| 2.1.4 主要溶液及其配方 | 第24-26页 |
| 2.2 方法 | 第26-29页 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 | 第26页 |
| 2.2.2 弓形虫的复苏及DNA提取 | 第26页 |
| 2.2.3 ROP18 基因的扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.4 重组表达质粒的构建 | 第27-28页 |
| 2.2.5 重组质粒的诱导表达 | 第28页 |
| 2.2.6 重组蛋白的纯化 | 第28页 |
| 2.2.7 ROP18免疫原性实验 | 第28页 |
| 2.2.8 ROP18 多克隆抗体的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.9 重组蛋白ROP18的Western-blot分析 | 第29页 |
| 2.2.10 重组蛋白ROP18 的间接免疫荧光试验(IFA)分析 | 第29页 |
| 2.3 结果与分析 | 第29-32页 |
| 2.3.1 ROP18 目的片段的扩增 | 第29页 |
| 2.3.2 重组质粒的鉴定 | 第29-30页 |
| 2.3.2.1 PCR鉴定 | 第29-30页 |
| 2.3.2.2 双酶切鉴定 | 第30页 |
| 2.3.3 重组蛋白的表达及可溶性鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3.4 重组蛋白纯化后SDS-PAGE分析 | 第31页 |
| 2.3.5 重组蛋白ROP18的Western-blot分析 | 第31-32页 |
| 2.3.6 间接免疫荧光试验(IFA)分析 | 第32页 |
| 2.4 讨论 | 第32-34页 |
| 第三章 ROP18 基因缺失株及互补株的构建 | 第34-51页 |
| 3.1 材料 | 第34-36页 |
| 3.1.1 实验动物与细胞 | 第34页 |
| 3.1.2 实验试剂及主要耗材 | 第34-35页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第35页 |
| 3.1.4 主要溶液及其配方 | 第35-36页 |
| 3.2 方法 | 第36-45页 |
| 3.2.1 VERO细胞的复苏、培养与传代 | 第36页 |
| 3.2.2 弓形虫RH株的传代及基因组提取 | 第36-37页 |
| 3.2.3 gRNA设计 | 第37页 |
| 3.2.4 pSAG1:Cas9::TgU6:sgROP18 质粒和同源重组质粒pROP18::DHFR-D的构建 | 第37-42页 |
| 3.2.4.1 质粒片段的扩增 | 第37-40页 |
| 3.2.4.2 质粒的环化连接 | 第40-41页 |
| 3.2.4.3 反应产物的转化涂板 | 第41页 |
| 3.2.4.4 阳性菌落的挑取和鉴定 | 第41-42页 |
| 3.2.5 单克隆虫株的筛选 | 第42-43页 |
| 3.2.6 ROP18 基因敲除后互补株的构建 | 第43-44页 |
| 3.2.7 Western-blot分析鉴定 | 第44页 |
| 3.2.8 间接双标免疫荧光试验分析 | 第44-45页 |
| 3.3 结果与分析 | 第45-49页 |
| 3.3.1 目的片段的扩增 | 第45-46页 |
| 3.3.2 质粒鉴定 | 第46-47页 |
| 3.3.3 ROP18 缺失株及互补株的PCR鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3.4 Western-blot鉴定 | 第48页 |
| 3.3.5 间接免疫荧光试验分析 | 第48-49页 |
| 3.4 讨论 | 第49-51页 |
| 第四章 ROP18 缺失株的生物学特性研究 | 第51-62页 |
| 4.1 材料 | 第51-52页 |
| 4.1.1 虫株、实验动物与细胞 | 第51页 |
| 4.1.2 实验试剂及主要耗材 | 第51-52页 |
| 4.1.3 实验仪器 | 第52页 |
| 4.2 方法 | 第52-56页 |
| 4.2.1 体外增殖实验 | 第52页 |
| 4.2.2 体外入侵细胞实验 | 第52页 |
| 4.2.3 噬斑实验 | 第52-53页 |
| 4.2.4 ROP18 缺失株的小鼠毒力实验 | 第53页 |
| 4.2.5 RAW264.7 细胞的复苏、培养 | 第53页 |
| 4.2.6 Irga6 引物的设计 | 第53页 |
| 4.2.7 RAW264.7 细胞基因组的提取 | 第53-54页 |
| 4.2.8 Irga6 基因的扩增 | 第54页 |
| 4.2.9 重组表达质粒的构建 | 第54-55页 |
| 4.2.10 重组质粒的诱导表达 | 第55页 |
| 4.2.11 重组蛋白的纯化 | 第55页 |
| 4.2.12 Irga6 多克隆抗体的制备 | 第55页 |
| 4.2.13 间接免疫荧光试验分析 | 第55-56页 |
| 4.3 结果与分析 | 第56-61页 |
| 4.3.1 体外增殖实验 | 第56页 |
| 4.3.2 体外入侵细胞实验 | 第56-57页 |
| 4.3.3 噬斑实验 | 第57-58页 |
| 4.3.4 ROP18 缺失株的小鼠毒力实验 | 第58页 |
| 4.3.5 Irga6 目的片段的扩增 | 第58页 |
| 4.3.6 重组质粒的鉴定 | 第58-60页 |
| 4.3.6.1 重组质粒的PCR鉴定 | 第59页 |
| 4.3.6.2 重组质粒的双酶切鉴定 | 第59-60页 |
| 4.3.7 重组蛋白的表达及可溶性鉴定 | 第60页 |
| 4.3.8 间接免疫荧光试验分析 | 第60-61页 |
| 4.4 讨论 | 第61-62页 |
| 第五章 弓形虫ROP18与TR双基因缺失虫株的构建及生物学功能的研究 | 第62-78页 |
| 5.1 材料 | 第62页 |
| 5.1.1 实验动物、虫株与细胞 | 第62页 |
| 5.1.2 实验试剂及主要耗材 | 第62页 |
| 5.1.3 仪器 | 第62页 |
| 5.2 方法 | 第62-68页 |
| 5.2.1 pROP18::CAT质粒片段的扩增 | 第62-63页 |
| 5.2.2 氯霉素抗性的ROP18 缺失株的构建 | 第63-64页 |
| 5.2.3 质粒pSAG1:Cas9::TgU6:TR3和pTR::DHFR-D的构建 | 第64-66页 |
| 5.2.4 RH-TR-KO株及RH-ROP18-TR-KO株的构建 | 第66-67页 |
| 5.2.5 Western-blot鉴定 | 第67页 |
| 5.2.6 间接双标免疫荧光试验分析 | 第67页 |
| 5.2.7 ROP18与TR双基因缺失株的生物学特性研究 | 第67-68页 |
| 5.2.7.1 体外增殖实验 | 第67页 |
| 5.2.7.2 体外入侵细胞实验 | 第67-68页 |
| 5.2.7.3 噬斑实验 | 第68页 |
| 5.2.7.4 小鼠毒力实验 | 第68页 |
| 5.3 结果 | 第68-76页 |
| 5.3.1 构建p ROP18::CAT质粒各片段的扩增 | 第68页 |
| 5.3.2 pROP18::CAT质粒的鉴定 | 第68-69页 |
| 5.3.3 RH-ROP18-KO(CAT)株的鉴定 | 第69-70页 |
| 5.3.4 pSAG1: Cas9::TgU6:sgTR1/2 质粒与pTR::DHFR-D质粒各片段的扩增 | 第70页 |
| 5.3.5 pSAG1: Cas9::TgU6:sgTR1/2 质粒与pTR::DHFR-D质粒的鉴定 | 第70-71页 |
| 5.3.6 pSAG1: Cas9::TgU6:sgTR3质粒的鉴定 | 第71-72页 |
| 5.3.7 RH-TR-KO株及RH-ROP18-TR-KO株的鉴定 | 第72-74页 |
| 5.3.7.1 PCR鉴定 | 第72页 |
| 5.3.7.2 Western-blot鉴定 | 第72-73页 |
| 5.3.7.3 间接双标免疫荧光试验分析 | 第73-74页 |
| 5.3.8 体外增殖实验 | 第74页 |
| 5.3.9 ROP18 与TR双基因敲除对虫株体外入侵细胞能力的影响 | 第74-75页 |
| 5.3.10 噬斑实验 | 第75-76页 |
| 5.3.11 ROP18 与TR双基因敲除株的小鼠毒力实验 | 第76页 |
| 5.4 讨论 | 第76-78页 |
| 第六章 全文结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 作者简历 | 第88页 |
