摘要 | 第7-9页 |
ABSTRACT | 第9-11页 |
前言 | 第16-18页 |
文献综述 | 第18-37页 |
第一章 动物骨骼肌发育及其非编码RNA调控研究进展 | 第18-37页 |
1.1 骨骼肌发育研究进展 | 第18-29页 |
1.1.1 生肌调控因子在骨骼肌形成过程中的作用 | 第18-20页 |
1.1.2 肌细胞增强因子2家族成员在骨骼肌形成过程中的作用 | 第20-22页 |
1.1.3 Pax3/Pax7与骨骼肌形成 | 第22-23页 |
1.1.4 Wnt信号与骨骼肌形成 | 第23-24页 |
1.1.5 Shh信号与骨骼肌形成 | 第24-25页 |
1.1.6 BMP信号与骨骼肌形成 | 第25-26页 |
1.1.7 Notch信号与骨骼肌形成 | 第26-27页 |
1.1.8 生长因子与骨骼肌形成 | 第27-29页 |
1.2 非编码RNA的研究进展 | 第29-35页 |
1.2.1 miRNA的研究进展 | 第29-32页 |
1.2.2 LncRNAs的研究进展 | 第32-35页 |
1.3 非编码RNA在牛骨骼肌发育中的研究概况 | 第35-37页 |
1.3.1 牛骨骼肌发育过程中涉及到的miRNAs | 第35页 |
1.3.2 牛骨骼肌发育过程中涉及到的lncRNAs | 第35-37页 |
试验研究 | 第37-89页 |
第二章 长链非编码RNA IGF2 AS的筛选、鉴定及表达规律分析 | 第37-47页 |
2.1 材料与方法 | 第37-40页 |
2.1.1 试验仪器 | 第37页 |
2.1.2 试验样品采集 | 第37页 |
2.1.3 RNA-seq文库构建和测序分析 | 第37-38页 |
2.1.4 差异表达lncRNA的筛选 | 第38页 |
2.1.5 牛原代骨骼肌细胞的分离培养 | 第38页 |
2.1.6 总RNA的提取和反转录 | 第38-39页 |
2.1.7 LncRNA全长序列获取及序列特征分析 | 第39-40页 |
2.1.8 实时荧光定量PCR分析 | 第40页 |
2.2 结果 | 第40-45页 |
2.2.1 牛不同发育阶段骨骼肌差异表达的lncRNA筛选 | 第40-42页 |
2.2.2 LncRNA IGF2 AS的序列获取和结构特征 | 第42页 |
2.2.3 LncRNA IGF2 AS的组织表达特征 | 第42-44页 |
2.2.4 LncRNA IGF2 AS在牛骨骼肌细胞生长和分化阶段的表达特征 | 第44-45页 |
2.3 讨论 | 第45-46页 |
2.4 小结 | 第46-47页 |
第三章 LNCRNA IGF2 AS对牛骨骼肌细胞增殖、分化和凋亡的调控研究 | 第47-59页 |
3.1 材料与方法 | 第47-50页 |
3.1.1 lncRNA IGF2 AS的过表达载体构建和干扰片段合成 | 第47-48页 |
3.1.2 牛骨骼肌原代细胞的分离培养和转染 | 第48页 |
3.1.3 细胞总RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR | 第48页 |
3.1.4 CCK-8检测细胞增殖状态 | 第48页 |
3.1.5 EdU检测细胞增殖阶段S期阳性细胞数目 | 第48页 |
3.1.6 细胞周期检测 | 第48-49页 |
3.1.7 蛋白免疫印迹 | 第49-50页 |
3.1.8 细胞免疫荧光 | 第50页 |
3.1.9 RNA-seq文库构建和测序分析 | 第50页 |
3.1.10 细胞凋亡检测 | 第50页 |
3.1.11 统计分析 | 第50页 |
3.2 结果 | 第50-57页 |
3.2.1 IGF2 AS促进牛骨骼肌细胞增殖 | 第50-53页 |
3.2.2 IGF2 AS促进牛骨骼肌细胞分化 | 第53-55页 |
3.2.3 IGF2 AS抑制牛骨骼肌细胞凋亡 | 第55-57页 |
3.3 讨论 | 第57-58页 |
3.4 小结 | 第58-59页 |
第四章 LNCRNA IGF2 AS调控牛骨骼肌发育的机制研究 | 第59-74页 |
4.1 材料与方法 | 第59-62页 |
4.1.1 RNA核质分离 | 第59页 |
4.1.2 荧光原位杂交 | 第59-60页 |
4.1.3 普通PCR扩增 | 第60页 |
4.1.4 实时荧光定量PCR | 第60页 |
4.1.5 RIP分析 | 第60页 |
4.1.6 载体构建和双荧光素酶报告分析 | 第60-61页 |
4.1.7 RNA pull down分析 | 第61页 |
4.1.8 蛋白免疫印迹 | 第61页 |
4.1.9 放线菌素D处理细胞 | 第61-62页 |
4.1.10 统计分析 | 第62页 |
4.2 结果 | 第62-72页 |
4.2.1 IGF2 AS的亚细胞定位 | 第62页 |
4.2.2 IGF2 AS可与其宿主基因IGF2 mRNA前体序列结合 | 第62-64页 |
4.2.3 IGF2 AS可能通过影响IGF2的稳定性调控IGF2的表达 | 第64-65页 |
4.2.4 IGF2 AS通过竞争性结合miR-221/miR-222促进牛骨骼肌细胞分化 | 第65-68页 |
4.2.5 IGF2 AS通过结合ILF3蛋白促进牛骨骼肌发育 | 第68-72页 |
4.3 讨论 | 第72-73页 |
4.4 小结 | 第73-74页 |
第五章 MIR-483的筛选及其对牛骨骼肌细胞增殖和分化的功能研究 | 第74-83页 |
5.1 材料与方法 | 第74-76页 |
5.1.1 试验样品 | 第74页 |
5.1.2 总RNA提取 | 第74页 |
5.1.3 miRNA测序文库构建 | 第74页 |
5.1.4 差异表达的miRNA筛选 | 第74页 |
5.1.5 牛骨骼肌原代细胞的分离培养和转染 | 第74-75页 |
5.1.6 miRNA特异反转录和实时荧光定量PCR | 第75页 |
5.1.7 CCK-8检测细胞增殖状态 | 第75页 |
5.1.8 EdU检测细胞增殖阶段S期阳性细胞数目 | 第75页 |
5.1.9 细胞周期检测 | 第75页 |
5.1.10 细胞免疫荧光 | 第75-76页 |
5.1.11 蛋白免疫印迹 | 第76页 |
5.1.12 统计分析 | 第76页 |
5.2 结果 | 第76-82页 |
5.2.1 miR-483的组织表达特征 | 第76页 |
5.2.2 miR-483在牛骨骼肌细胞生长和分化阶段的时序分析 | 第76-77页 |
5.2.3 miR-483抑制牛骨骼肌细胞增殖 | 第77-79页 |
5.2.4 miR-483抑制牛骨骼肌细胞分化 | 第79-82页 |
5.3 讨论 | 第82页 |
5.4 小结 | 第82-83页 |
第六章 MIR-483通过IGF1/PI3K/AKT信号通路调控牛骨骼肌细胞增殖和分化 | 第83-89页 |
6.1 材料与方法 | 第83页 |
6.1.1 miR-483的靶基因预测 | 第83页 |
6.1.2 细胞培养 | 第83页 |
6.1.3 载体构建和双荧光素酶报告分析 | 第83页 |
6.1.4 蛋白免疫印迹 | 第83页 |
6.1.5 统计分析 | 第83页 |
6.2 结果 | 第83-87页 |
6.2.1 miR-483的序列保守性分析和靶基因预测 | 第83-84页 |
6.2.2 miR-483降低IGF1双荧光素酶报告载体活性 | 第84-85页 |
6.2.3 miR-483通过IGF1/PI3K/AKT信号通路调控牛骨骼肌细胞增殖和分化 | 第85-87页 |
6.3 讨论 | 第87-88页 |
6.4 小结 | 第88-89页 |
结论与创新点 | 第89-90页 |
结论 | 第89页 |
创新点 | 第89-90页 |
参考文献 | 第90-99页 |
附录 | 第99-113页 |
致谢 | 第113-114页 |
个人简历 | 第114-115页 |