| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-22页 |
| 1.1 人参皂苷概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 人参皂苷的化学结构 | 第10页 |
| 1.1.2 人参皂苷的理化性质 | 第10页 |
| 1.1.3 人参皂苷的药理作用 | 第10-11页 |
| 1.1.4 人参皂苷结构改造 | 第11-12页 |
| 1.2 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶 | 第12页 |
| 1.2.1 在酶学方面的研究 | 第12页 |
| 1.2.2 在分子生物学方面的研究 | 第12页 |
| 1.3 研究人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的分子生物学方法 | 第12-20页 |
| 1.3.1 RNA的提取 | 第12-13页 |
| 1.3.2 使用PCR技术扩增基因 | 第13-17页 |
| 1.3.2.1 RT-PCR技术 | 第14页 |
| 1.3.2.2 RACE技术扩增未知基因末端 | 第14-17页 |
| 1.3.3 克隆技术 | 第17-19页 |
| 1.3.4 序列的测定与分析 | 第19-20页 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 | 第20-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-46页 |
| 2.1 实验材料与工具 | 第22-24页 |
| 2.1.1 菌株与载体 | 第22页 |
| 2.1.2 培养基 | 第22页 |
| 2.1.3 实验仪器与设备 | 第22-23页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-46页 |
| 2.2.1 液体发酵培养基成分的制备 | 第24-25页 |
| 2.2.1.1 麸皮浸出液的制备 | 第24-25页 |
| 2.2.1.2 人参浸出液的制备 | 第25页 |
| 2.2.2 菌株液体发酵条件确定 | 第25-26页 |
| 2.2.2.1 培养基中诱导物浓度的确定 | 第25-26页 |
| 2.2.2.2 发酵时间的确定 | 第26页 |
| 2.2.3 发酵产酶活性检测 | 第26-27页 |
| 2.2.3.1 接菌与培养 | 第26页 |
| 2.2.3.2 酶液提取与酶反应 | 第26-27页 |
| 2.2.3.3 酶活力检测 | 第27页 |
| 2.2.4 菌体收集 | 第27页 |
| 2.2.5 RNA的提取方法确定 | 第27-29页 |
| 2.2.5.1 LiCl法 | 第28页 |
| 2.2.5.2 异硫氰酸胍法 | 第28-29页 |
| 2.2.5.3 RNAiso Reagent改进法 | 第29页 |
| 2.2.6 RNA的质量的检测 | 第29-31页 |
| 2.2.6.1 吸光值检测 | 第29-30页 |
| 2.2.6.2 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第30-31页 |
| 2.2.7 RNA的DNA Rase处理与精制 | 第31-32页 |
| 2.2.7.1 RNA的DNA Rase消化反应 | 第31页 |
| 2.2.7.2 RNA的精制 | 第31-32页 |
| 2.2.8 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因全序列调取 | 第32-41页 |
| 2.2.8.1 CDS区基因部分序列的扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.8.2 CDS区基因部分序列产物回收 | 第33-34页 |
| 2.2.8.3 使用RACE技术扩增基因3'和5'端的序列 | 第34-41页 |
| 2.2.9 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因全序列的拼接与比对 | 第41页 |
| 2.2.10 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶CDS区基因的克隆 | 第41-46页 |
| 2.2.10.1 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因CDS区基因的获取 | 第41-42页 |
| 2.2.10.2 PCR产物和载体的连接 | 第42-43页 |
| 2.2.10.3 转化及重组子的筛选 | 第43-44页 |
| 2.2.10.4 重组质粒的提取 | 第44-45页 |
| 2.2.10.5 重组质粒DNA酶切检测 | 第45页 |
| 2.2.10.6 序列分析 | 第45-46页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第46-71页 |
| 3.1 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶液体发酵条件的研究 | 第46-49页 |
| 3.1.1 液体发酵培养基最佳诱导物浓度的确定 | 第46-48页 |
| 3.1.2 发酵时间的研究 | 第48-49页 |
| 3.2 总RNA的提取 | 第49-53页 |
| 3.2.1 RNA提取方法的确定 | 第49-51页 |
| 3.2.1.1 LiCl法提取RNA结果检测 | 第49-50页 |
| 3.2.1.2 异硫氰酸胍法提取RNA结果检测 | 第50页 |
| 3.2.1.3 RNAiso Reagent试剂盒改进法提取RNA结果检测 | 第50-51页 |
| 3.2.2 RNA的纯化 | 第51-52页 |
| 3.2.3 RNA的纯度和完整性的检测 | 第52-53页 |
| 3.2.3.1 吸光值检测 | 第52-53页 |
| 3.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第53页 |
| 3.3 基因序列的调取 | 第53-64页 |
| 3.3.1 CDS区基因部分序列的调取 | 第54-55页 |
| 3.3.1.1 引物的设计 | 第54页 |
| 3.3.1.2 引物的合成 | 第54页 |
| 3.3.1.3 扩增人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因 | 第54-55页 |
| 3.3.2 基因全序列的扩增 | 第55-64页 |
| 3.3.2.1 3'RACE产物检测 | 第55-59页 |
| 3.3.2.2 5’RACE产物检测 | 第59-61页 |
| 3.3.2.3 基因全长序列拼接和基因同源性比对 | 第61-64页 |
| 3.4 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因CDS区扩增和克隆 | 第64-71页 |
| 3.4.1 引物设计 | 第64页 |
| 3.4.2 CDS区基因调取 | 第64-65页 |
| 3.4.3 基因片段上“A”处理 | 第65页 |
| 3.4.4 将目的片段与载体连接 | 第65-66页 |
| 3.4.5 重组质粒PCR检测 | 第66-67页 |
| 3.4.6 提取质粒检测 | 第67-68页 |
| 3.4.7 重组质粒的酶切鉴定 | 第68页 |
| 3.4.8 克隆后质粒的测序与分析 | 第68-71页 |
| 第四章 结论 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 附录A | 第76-77页 |
| 附录B | 第77页 |
