| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-10页 |
| 第一章 引言 | 第18-28页 |
| 1.1 新城疫病毒介绍 | 第18-19页 |
| 1.2 HMGB1研究进展 | 第19-27页 |
| 1.2.1 HMGB1基本结构和核内功能 | 第19-20页 |
| 1.2.2 HMGB1释放至细胞外发挥炎性因子功能 | 第20-21页 |
| 1.2.3 HMGB1的互作和受体 | 第21-25页 |
| 1.2.3.1 HMGB1与RAGE受体及其下游炎症通路 | 第23-25页 |
| 1.2.3.2 HMGB1与Toll样受体信号通路 | 第25页 |
| 1.2.4 HMGB1参与到病毒感染性疾病中 | 第25-27页 |
| 1.3 HMGB1蛋白与病毒感染研究展望 | 第27页 |
| 1.4 本研究目的及意义 | 第27-28页 |
| 第二章 鸡HMGB1基因扩增以及基本功能分析 | 第28-38页 |
| 2.1 材料和方法 | 第28-32页 |
| 2.1.1 细胞和实验动物使用 | 第28页 |
| 2.1.2 原核表达载体和主要试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.3 主要缓冲液及试剂的配制 | 第29页 |
| 2.1.4 鸡胚成纤维细胞CEF细胞制备和总RNA提取及反转录 | 第29页 |
| 2.1.5 鸡/人HMGB1基因扩增与GFP真核表达质粒构建 | 第29-30页 |
| 2.1.6 鸡HMGB1序列分析 | 第30-31页 |
| 2.1.7 鸡HMGB1亚细胞定位分析 | 第31页 |
| 2.1.8 半定量PCR实验检测鸡HMGB1在正常鸡体内的组织分布 | 第31-32页 |
| 2.2 结果 | 第32-36页 |
| 2.2.1 鸡/人HMGB1基因扩增及pEGFP-N1-chHMGB1质粒构建 | 第32-33页 |
| 2.2.2 鸡HMGB1序列分析及遗传进化树分析 | 第33-34页 |
| 2.2.3 鸡HMGB1蛋白亚细胞定位分析 | 第34-35页 |
| 2.2.4 鸡HMGB1在正常鸡体内组织分布 | 第35-36页 |
| 2.3 讨论 | 第36-38页 |
| 第三章 鸡HMGB1蛋白的原核表达和抗体制备 | 第38-53页 |
| 3.1 材料和方法 | 第38-43页 |
| 3.1.1 细胞和实验动物使用 | 第38-39页 |
| 3.1.2 表达载体和主要试剂 | 第39页 |
| 3.1.3 主要缓冲液及试剂的配制 | 第39-40页 |
| 3.1.4 鸡HMGB1与人HMMGB1重组质粒构建 | 第40页 |
| 3.1.5 重组鸡HMGB1蛋白的原核表达及纯化 | 第40-41页 |
| 3.1.6 免疫小鼠及多克隆抗体的制备 | 第41页 |
| 3.1.7 单克隆抗体的制备 | 第41页 |
| 3.1.8 抗体ELISA、WesternBlot和IFA效价的检测 | 第41-42页 |
| 3.1.8.1 抗体ELISA效价检测 | 第41页 |
| 3.1.8.2 WesternBlot检测 | 第41-42页 |
| 3.1.8.3 间接免疫荧光鉴定 | 第42页 |
| 3.1.9 chHMGB1单克隆抗体细胞特异性检测 | 第42页 |
| 3.1.10 chHMGB1单克隆抗体中和效价检测 | 第42-43页 |
| 3.2 结果 | 第43-51页 |
| 3.2.1 鸡/人HMGB1基因原核表达载体和真核表达载体构建 | 第43-44页 |
| 3.2.2 pET-28a-chHMGB1重组蛋白的诱导表达及纯化 | 第44-46页 |
| 3.2.3 pET-28a-chHMGB1蛋白多克隆抗体和单克隆抗体ELISA效价检测 | 第46页 |
| 3.2.4 pET-28a-chHMGB1蛋白多克隆抗体和单克隆抗体Westernblot效价 | 第46-47页 |
| 3.2.5 pET-28a-chHMGB1蛋白多克隆抗体和单克隆抗体间接免疫荧光效价 | 第47-49页 |
| 3.2.6 pET-28a-chHMGB1蛋白多克隆抗体和单克隆抗体特异性检测 | 第49-50页 |
| 3.2.7 pET-28a-chHMGB1蛋白单克隆抗体中和效价检测 | 第50-51页 |
| 3.3 讨论 | 第51-53页 |
| 第四章 新城疫病毒感染细胞诱导HMGB1蛋白释放 | 第53-62页 |
| 4.1 材料和方法 | 第54-57页 |
| 4.1.1 细胞和毒株 | 第54页 |
| 4.1.2 抗体及主要试剂 | 第54页 |
| 4.1.3 主要缓冲液及试剂配制 | 第54-55页 |
| 4.1.4 间接免疫荧光检测NDV感染后HMGB1定位 | 第55页 |
| 4.1.5 WesternBlot检测NDV感染后细胞内HMGB1蛋白水平变化 | 第55-56页 |
| 4.1.6 实时荧光定量PCR检测NDV感染后细胞HMGB1mRNA水平的变化 | 第56页 |
| 4.1.7 ELISA检测NDV感染细胞上清中HMGB1水平 | 第56-57页 |
| 4.1.8 ELISA检测不同感染量NDV感染细胞上清HMGB1水平 | 第57页 |
| 4.2 结果 | 第57-61页 |
| 4.2.1 NDV感染DF1细胞和A549细胞引起HMGB1蛋白出核 | 第57-58页 |
| 4.2.2 NDV感染后不显著诱导细胞内HMGB1蛋白表达量变化 | 第58-60页 |
| 4.2.3 NDV感染A549细胞后诱导HMGB1释放至细胞上清 | 第60-61页 |
| 4.3 讨论 | 第61-62页 |
| 第五章 HMGB1蛋白对NDV在细胞内复制的影响 | 第62-73页 |
| 5.1 材料和方法 | 第63-65页 |
| 5.1.1 细胞和毒株 | 第63页 |
| 5.1.2 抗体及主要试剂 | 第63页 |
| 5.1.3 主要缓冲液及试剂配制 | 第63页 |
| 5.1.4 过表达HMGB1蛋白对新城疫病毒在DF1细胞和A549细胞中复制的影响 | 第63-64页 |
| 5.1.5 外源加入HMGB1蛋白对NDV在细胞中复制的影响 | 第64页 |
| 5.1.6 超氧化物歧化酶(WST-1)法筛选HMGB1抑制剂最适工作浓度 | 第64-65页 |
| 5.1.7 HMGB1抑制剂对NDV在细胞中复制的影响 | 第65页 |
| 5.1.8 chHMGB中和抗体对NDV在DF1细胞中复制的影响 | 第65页 |
| 5.2 结果 | 第65-71页 |
| 5.2.1 过表达HMGB1蛋白对NDV在DF1和A549细胞中复制无影响 | 第65-66页 |
| 5.2.2 外源加入HMGB1蛋白对NDV在DF1和A549细胞中复制无影响 | 第66-68页 |
| 5.2.3 HMGB1抑制剂最适工作浓度确定 | 第68-69页 |
| 5.2.4 抑制剂EP和GA不影响NDV在DF1和A549细胞中复制 | 第69-70页 |
| 5.2.5 chHMGB1中和抗体不影响NDV在DF1和A549细胞上复制 | 第70-71页 |
| 5.3 讨论 | 第71-73页 |
| 第六章 HMGB1参与新城疫病毒激活NF-κB信号通路和诱导炎症反应 | 第73-96页 |
| 6.1 材料和方法 | 第74-80页 |
| 6.1.1 细胞与毒株 | 第74页 |
| 6.1.2 抗体及主要试剂 | 第74页 |
| 6.1.3 主要缓冲液及试剂配制 | 第74页 |
| 6.1.4 qPCR实验检测NDV感染对下游炎症因子mRNA水平的影响 | 第74-75页 |
| 6.1.5 ELISA检测NDV感染A549细胞上清中炎症因子含量 | 第75页 |
| 6.1.6 ELISA检测不同感染剂量NDV感染A549细胞上清中炎症因子含量 | 第75-76页 |
| 6.1.7 NDV感染SPF鸡组织炎症因子mRNA水平检测 | 第76页 |
| 6.1.8 NDV感染对细胞内NF-κB信号通路的影响 | 第76页 |
| 6.1.9 外源加入HMGB1蛋白对NDV诱导炎症因子mRNA水平变化的影响 | 第76-77页 |
| 6.1.10 HMGB1抑制剂对NDV诱导下游炎症因子mRNA水平变化的影响 | 第77页 |
| 6.1.11 chHMGB1中和抗体对NDV诱导下游炎症因子mRNA水平变化的影响 | 第77-78页 |
| 6.1.12 外源加入HMGB1蛋白对NDV激活NF-κB信号通路的影响 | 第78页 |
| 6.1.13 HMGB1,TLR3,TLR4和RAGEsiRNA干扰条件摸索干扰条件摸索 | 第78页 |
| 6.1.14 干扰HMGB1对NDV激活NF-κB信号通路的影响 | 第78-79页 |
| 6.1.15 TLR3受体、TLR4受体、RAGE受体干扰对新城疫病毒诱导下游炎症因子上调的影响 | 第79页 |
| 6.1.16 chHMGB1抗体中和体内实验 | 第79-80页 |
| 6.2 结果 | 第80-94页 |
| 6.2.1 NDV感染细胞引起炎症因子mRNA水平上调 | 第80-81页 |
| 6.2.2 NDV感染A549细胞诱导炎症因子分泌至细胞上清 | 第81-82页 |
| 6.2.3 NDV感染鸡体后各个组织器官中炎症因子mRNA水平上调 | 第82-83页 |
| 6.2.4 NDV感染激活细胞内NF-κB信号通路 | 第83-84页 |
| 6.2.5 外源加入HMGB1蛋白促进NDV诱导炎症因子mRNA水平上调 | 第84-86页 |
| 6.2.6 HMGB1抑制剂抑制NDV诱导下游炎症因子mRNA水平上调 | 第86-87页 |
| 6.2.7 chHMGB1中和抗体抑制NDV诱导下游炎症因子mRNA水平上调 | 第87页 |
| 6.2.8 外源加入HMGB1蛋白促进NDV激活NF-κB信号通路 | 第87-88页 |
| 6.2.9 针对人HMGB1siRNA干扰条件摸索 | 第88-89页 |
| 6.2.10 干扰HMGB1抑制NDV激活NF-κB信号通路 | 第89-90页 |
| 6.2.11 TLR3、RAGE、TLR4受体蛋白干扰RNA条件确定 | 第90-91页 |
| 6.2.12 干扰TLR3受体对NDV在A549细胞上诱导炎症因子上调无影响 | 第91-92页 |
| 6.2.13 干扰RAGE抑制NDV在A549细胞上诱导炎症因子上调 | 第92-93页 |
| 6.2.14 干扰TLR4抑制NDV在A549细胞上诱导炎症因子上调 | 第93-94页 |
| 6.2.15 chHMGB1抗体中和体内实验 | 第94页 |
| 6.3 讨论 | 第94-96页 |
| 第七章 全文结论 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 作者简历 | 第110页 |
