| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 绪论 | 第10-19页 |
| 第一节 真菌细胞壁的化学组成与研究 | 第10-12页 |
| 1.1 真菌细胞壁的化学组成 | 第10-11页 |
| 1.2 真菌细胞壁的水解酶 | 第11-12页 |
| 第二节 真菌细胞遗传转化研究进展 | 第12-14页 |
| 2.1 真菌细胞原生质体的形成 | 第13页 |
| 2.2 遗传转化系统中筛选标记的构建 | 第13-14页 |
| 第三节 CRISPR-Cas9系统的研究与发展 | 第14-17页 |
| 3.1 CRISPR-Cas9系统发展的背景与应用 | 第14-15页 |
| 3.2 CRISPR-Cas9基因编辑面临的挑战和解决方法 | 第15-17页 |
| 第四节 本论文研究的主要目的和意义 | 第17-19页 |
| 第2章 利用几丁质酶ChiⅢ和ChiEn1制备灰盖鬼伞的原生质体 | 第19-29页 |
| 1 材料与方法 | 第19-23页 |
| 1.1 实验材料 | 第19页 |
| 1.2 培养基及试剂 | 第19-20页 |
| 1.3 实验仪器 | 第20-21页 |
| 1.4 蛋白质的浓缩 | 第21页 |
| 1.5 灰盖鬼伞粉孢子的诱导产生 | 第21页 |
| 1.6 灰盖鬼伞粉孢子细胞壁的酶解 | 第21-22页 |
| 1.7 酶解细胞壁后原生质体再生的计数观察 | 第22页 |
| 1.8 透射电镜观察样品处理 | 第22-23页 |
| 2 结果 | 第23-28页 |
| 2.1 细胞壁酶解后光学显微镜的观察与计数 | 第23-25页 |
| 2.2 细胞壁酶解后原生质体再生的观察与计数 | 第25-26页 |
| 2.3 灰盖鬼伞粉孢子细胞壁酶解后超微结构观察 | 第26-28页 |
| 3 讨论 | 第28-29页 |
| 第3章 灰盖鬼伞中萎锈灵抗性筛选标记的构建 | 第29-41页 |
| 1 材料与方法 | 第29-37页 |
| 1.1 实验材料 | 第29页 |
| 1.2 培养基及试剂 | 第29-30页 |
| 1.3 实验仪器 | 第30-31页 |
| 1.4 CTAB法提取灰盖鬼伞基因组的提取 | 第31页 |
| 1.5 构建Carboxin抗性质粒pCccbx | 第31-35页 |
| 1.6 用pab1营养标记质粒pEASY-zero-pab1和pCccbx共转化营养缺陷型菌株AmutBmut | 第35页 |
| 1.7 筛选阳性转化子 | 第35-37页 |
| 1.8 点圈实验 | 第37页 |
| 2 结果 | 第37-39页 |
| 2.1 Carboxin抗性质粒PCccbx的构建 | 第37-38页 |
| 2.2 pEASY-zero-pab1和pCccbx共转化菌株AmutBmut阳性转化子的筛选 | 第38-39页 |
| 2.3 点圈实验证明阳性转化子对Carboxin产生抗性 | 第39页 |
| 3 讨论 | 第39-41页 |
| 第4章 灰盖鬼伞中CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑的探究 | 第41-69页 |
| 第一节 Cas9-sgRNA质粒介导的灰盖鬼伞基因编辑的探究 | 第41-53页 |
| 1 材料与方法 | 第41-48页 |
| 1.1 实验材料 | 第41页 |
| 1.2 培养基及试剂 | 第41页 |
| 1.3 实验仪器 | 第41页 |
| 1.4 pCcEXP-Cas9质粒的构建 | 第41-43页 |
| 1.5 以pab1营养标记质粒pEASY-zero-pab1和pCcEXP-Cas9质粒共转化营养缺陷型菌株AmutBmut转化子的筛选和验证 | 第43-44页 |
| 1.6 Western blot验证阳性转化子Cas9蛋白的表达 | 第44-45页 |
| 1.7 荧光定量PCR验证阳性转化子Cas9蛋白mRNA水平的表达 | 第45-47页 |
| 1.8 Cas9基因的表达优化 | 第47-48页 |
| 1.9 pCcEXP-iACas9、pCcEXP-iBCas9质粒在灰盖鬼伞中的表达 | 第48页 |
| 2 结果 | 第48-53页 |
| 2.1 pCcEXP-Cas9质粒的构建 | 第48页 |
| 2.2 以pab1营养标记质粒pEASY-zero-pab1和pCcEXP-Cas9质粒共转化营养缺陷型菌株AmuBmut | 第48-50页 |
| 2.3 Cas9基因优化 | 第50-53页 |
| 第二节 RNA引导的内切核酸酶(RNA-guided endonucleases,RGENs)介导的灰盖鬼伞基因编辑的研究 | 第53-67页 |
| 1 材料与方法 | 第54-61页 |
| 1.1 实验材料 | 第54页 |
| 1.2 培养基及试剂 | 第54页 |
| 1.3 实验仪器 | 第54页 |
| 1.4 表达菌pET-NLS-Cas9-6xHis-E.coli Rosetta的构建 | 第54-55页 |
| 1.5 Cas9基因的诱导表达纯化 | 第55-56页 |
| 1.6 设计获得sgRNA基因 | 第56-58页 |
| 1.7 RNPs与同源重组片段up-pab1-down共转化到灰盖鬼伞AmutBmut菌株 | 第58-59页 |
| 1.8 体外剪切靶质粒pCcpyrG-target的构建 | 第59-60页 |
| 1.9 Cas9蛋白体外剪切pCcpyrG-target质粒 | 第60-61页 |
| 2 结果 | 第61-67页 |
| 2.1 表达菌pET-NLS-Cas9-6xHis-E.coli Rosetta的构建 | 第61页 |
| 2.2 Cas9蛋白的诱导表达、检测与纯化 | 第61-63页 |
| 2.3 PCR扩增获得sgRNA基因片段 | 第63-64页 |
| 2.4 RNPs与同源重组片段up-pab1-down共转化到灰盖鬼伞AmutBmut菌株 | 第64-65页 |
| 2.5 用于体外剪切的超螺旋质粒DNA pCcpyrG-target的构建 | 第65-66页 |
| 2.6 Cas9蛋白体外剪切超螺旋质粒DNA pCcpyrG-target | 第66-67页 |
| 第三节 讨论 | 第67-69页 |
| 第5章 全文总结 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-78页 |
| 在读期间发表的学术论文与成果 | 第78-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
