| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一章 综述 | 第13-23页 |
| 1 重组概述 | 第13页 |
| 1.1 DNA重组 | 第13页 |
| 1.2 同源重组 | 第13页 |
| 2 重组工程 | 第13-16页 |
| 2.1 重组工程的定义 | 第13-14页 |
| 2.2 重组工程的作用机理 | 第14页 |
| 2.3 重组工程操作中的关键因素 | 第14-15页 |
| 2.4 重组工程的操作类型 | 第15-16页 |
| 2.5 重组工程中的负筛选标记 | 第16页 |
| 3 CRISPR-Cas9编辑系统 | 第16-20页 |
| 3.1 CRISPR-Cas9编辑系统概述 | 第16-17页 |
| 3.2 CRISPR/Cas的基因结构 | 第17-18页 |
| 3.3 CRISPR-Cas9编辑系统防御过程 | 第18页 |
| 3.4 CRISPR-Cas9的研究进展 | 第18-19页 |
| 3.5 CRISPR-Cas9编辑系统的广泛应用 | 第19-20页 |
| 3.6 寡核苷酸重组工程联合CRISPR-Cas9系统基因编辑的思路 | 第20页 |
| 4 神经氨酸 | 第20-23页 |
| 4.1 N-乙酰-神经氨酸的合成 | 第20-21页 |
| 4.2 与Neu5Ac合成相关的基因 | 第21-23页 |
| 第二章 大肠杆菌引发酶DnaG基因突变 | 第23-62页 |
| 第一节 大肠杆菌引发酶DnaG Q576A突变 | 第24-49页 |
| 1 实验材料 | 第24-29页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第24-25页 |
| 1.2 引物的合成及测序 | 第25-27页 |
| 1.3 主要实验仪器设备 | 第27页 |
| 1.4 主要工具酶及各种化学试剂 | 第27-28页 |
| 1.5 主要培养基及溶液的配制 | 第28-29页 |
| 2 实验方法 | 第29-36页 |
| 2.1 常规分子生物学操作方法 | 第29-30页 |
| 2.2 质粒的构建 | 第30-33页 |
| 2.3 归巢内切酶I-SceI介导的单质粒系统无痕敲除体系 | 第33-35页 |
| 2.4 含有重组酶和cas9诱导表达的E.coli DH10B菌株的电转感受态细胞的制备以及DNA的电转化 | 第35页 |
| 2.5 cas9表达质粒的消除 | 第35-36页 |
| 2.6 sgRNA表达质粒的消除 | 第36页 |
| 2.7 寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9联合介导的DnaG基因编辑方法 | 第36页 |
| 3 实验结果 | 第36-49页 |
| 3.1 两种cas9表达质粒 | 第36-37页 |
| 3.2 基于高拷贝复制子Q576A sgRNA表达载体 | 第37-38页 |
| 3.3 基于中等拷贝复制子Q576A sgRNA表达载体 | 第38页 |
| 3.4 基于高拷贝复制子的自剪切Q576A sgRNA表达载体 | 第38-39页 |
| 3.5 Q576A sgRNA表达载体诱导自消除测定 | 第39页 |
| 3.6 E.coli DH10B错配修复基因mutS的敲除 | 第39-40页 |
| 3.7 cas9表达质粒转化E.coli LS3508 | 第40-41页 |
| 3.8 比较两种cas9表达系统转化效率 | 第41-43页 |
| 3.9 比较cas9表达质粒配合自剪切sgRNA表达质粒转化效率 | 第43-44页 |
| 3.10 比较基于基因组的Red和持续表达的Cas9系统转化效率 | 第44-46页 |
| 3.11 大肠杆菌引发酶DnaG Q576A点突变 | 第46-48页 |
| 3.12 E.coli LS35 13菌株中pLS3545的消除 | 第48-49页 |
| 第二节 大肠杆菌引发酶DnaG K580A点突变 | 第49-51页 |
| 1 实验材料 | 第49页 |
| 2 实验方法 | 第49页 |
| 2.1 质粒构建 | 第49页 |
| 3 实验结果 | 第49-51页 |
| 3.1 自剪切K580A sgRNA表达载体 | 第49-50页 |
| 3.2 K580A sgRNA表达载体诱导自消除测定 | 第50页 |
| 3.3 大肠杆菌引发酶DnaG K580A点突变 | 第50页 |
| 3.4 E.coli LS35 16菌株中pLS3547的消除 | 第50-51页 |
| 第三节 大肠杆菌引发酶DnaG Q576A-K580A点突变 | 第51-62页 |
| 1 实验材料 | 第51页 |
| 2 实验方法 | 第51页 |
| 2.1 质粒的构建 | 第51页 |
| 3 实验结果 | 第51-60页 |
| 3.1 E.coli LS3514 K580A点突变 | 第51-53页 |
| 3.2 E.coli LS3552 T576A点突变 | 第53-57页 |
| 3.3 E.coli LS3517 T576A点突变 | 第57-58页 |
| 3.4 E.coli LS3553 T576A点突变 | 第58-59页 |
| 3.5 E.coli LS3519T和 coli LS3519V菌株中pLS3547的消除 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-62页 |
| 第三章 寡核苷酸和CRISPR-Cas9联合介导的大肠杆菌ppsA和csrB基因高表达 | 第62-74页 |
| 第一节 诱导型ccdB基因和诱导型ScGNA1基因负筛选标记的建立 | 第62-67页 |
| 1 实验材料 | 第62-63页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第62页 |
| 1.2 引物的合成及测序 | 第62-63页 |
| 1.3 溶液的配制 | 第63页 |
| 2 实验方法 | 第63-64页 |
| 3 实验结果 | 第64-66页 |
| 3.1 诱导型负筛选标记的实验思路 | 第64-65页 |
| 3.2 E.coli LS1801/pLS2943 L-鼠李糖诱导的Red系统 | 第65页 |
| 3.3 E.coli LS1801/pLS2945间甲基苯甲酸诱导的Red系统 | 第65-66页 |
| 4 讨论 | 第66-67页 |
| 第二节 寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9联合介导的大肠杆菌基因上启动子的插入 | 第67-74页 |
| 1 实验材料 | 第67-68页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第67-68页 |
| 2 实验方法 | 第68页 |
| 2.1 质粒的构建 | 第68页 |
| 2.2 cas9表达质粒转化E.coli LS1801 | 第68页 |
| 3 实验结果 | 第68-73页 |
| 3.1 ppsA-csrB自剪切sgRNA表达质粒 | 第68-69页 |
| 3.2 大肠杆菌两种转化效率的测定 | 第69-70页 |
| 3.3 ppsA和csrB中T7启动子的插入 | 第70-71页 |
| 3.4 csrB中T7启动子的插入 | 第71-72页 |
| 3.5 E.coli LS3561,E.coli LS3571,E.coli LS3581中sgRNA表达质粒的的消除 | 第72页 |
| 3.6 E.coli LS3562,E.coli LS3572,E.coli LS3582中cas9表达质粒的的消除 | 第72-73页 |
| 4 讨论 | 第73-74页 |
| 总结 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-80页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
