| 中文摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 缩略词表 | 第11-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-38页 |
| 1.1 结核病与结核疫苗 | 第17-27页 |
| 1.1.1 结核病 | 第17-18页 |
| 1.1.2 结核分枝杆菌 | 第18-23页 |
| 1.1.2.1 结核分枝杆菌的感染与肉芽肿的形成 | 第19-21页 |
| 1.1.2.2 结核分枝杆菌感染后的先天性免疫应答 | 第21-22页 |
| 1.1.2.3 结核分枝杆菌感染后的适应性免疫应答 | 第22-23页 |
| 1.1.3 结核疫苗 | 第23-27页 |
| 1.1.3.1 减毒活疫苗 | 第25-26页 |
| 1.1.3.2 蛋白亚单位疫苗 | 第26页 |
| 1.1.3.3 病毒载体疫苗 | 第26-27页 |
| 1.2 结核分枝杆菌抗原 | 第27-29页 |
| 1.2.1 Ag85B | 第28-29页 |
| 1.2.2 TB10.4 | 第29页 |
| 1.3 病毒疫苗载体 | 第29-31页 |
| 1.3.1 腺病毒载体 | 第29-30页 |
| 1.3.2 痘病毒载体 | 第30-31页 |
| 1.4 细菌样颗粒 | 第31-35页 |
| 1.5 立题依据、创新点及实验设计 | 第35-38页 |
| 1.5.1 立题依据 | 第35-36页 |
| 1.5.2 创新点 | 第36页 |
| 1.5.3 实验设计思路 | 第36-38页 |
| 第二章 基于AD和MVA载体的重组结核疫苗研究 | 第38-70页 |
| 2.1 实验材料 | 第38-42页 |
| 2.1.1 主要仪器 | 第38-39页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第39-40页 |
| 2.1.3 常规配置试剂 | 第40页 |
| 2.1.4 菌株、质粒、细胞、病毒 | 第40-41页 |
| 2.1.5 抗体 | 第41页 |
| 2.1.6 抗原肽 | 第41-42页 |
| 2.2 实验方法 | 第42-54页 |
| 2.2.1 抗原基因的获取 | 第42-44页 |
| 2.2.1.1 提取BCG的基因组 | 第42页 |
| 2.2.1.2 PCR获取Ag85B和TB10.4 基因 | 第42-43页 |
| 2.2.1.3 重叠延伸PCR获得Ag85B-TB10.4融合基因 | 第43页 |
| 2.2.1.4 Ag85B-TB10.4 连入pGEM-T easy载体 | 第43-44页 |
| 2.2.2 验证抗原基因的表达 | 第44-45页 |
| 2.2.2.1 构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ag85B-TB10.4 | 第44页 |
| 2.2.2.2 验证Ag85B-TB10.4 的表达 | 第44-45页 |
| 2.2.3 构建重组腺病毒结核疫苗AdH4 | 第45-47页 |
| 2.2.3.1 AdH4的构建和筛选 | 第45-46页 |
| 2.2.3.2 AdH4的扩增与纯化 | 第46页 |
| 2.2.3.3 AdH4的鉴定与滴度测定 | 第46-47页 |
| 2.2.4 构建重组MVA载体结核疫苗MVAH4 | 第47-50页 |
| 2.2.4.1 MVAH4的构建及筛选 | 第48页 |
| 2.2.4.2 MVAH4的扩增和纯化 | 第48-49页 |
| 2.2.4.3 MVAH4的鉴定和滴度测定 | 第49-50页 |
| 2.2.5 免疫方案 | 第50-51页 |
| 2.2.6 免疫原性检测 | 第51-54页 |
| 2.2.6.1 特异性抗体检测 | 第51-52页 |
| 2.2.6.2 脾细胞处理 | 第52页 |
| 2.2.6.3 IFN-γ ELISpot分析 | 第52-53页 |
| 2.2.6.4 细胞因子分析 | 第53页 |
| 2.2.6.5 流式细胞分析 | 第53页 |
| 2.2.6.6 细胞杀伤实验 | 第53-54页 |
| 2.3 实验结果 | 第54-67页 |
| 2.3.1 Ag85B-TB10.4 融合基因的获取和表达验证 | 第54-57页 |
| 2.3.1.1 Ag85B-TB10.4 融合基因的获取 | 第54-56页 |
| 2.3.1.2 Ag85B-TB10.4 的表达验证 | 第56-57页 |
| 2.3.2 重组腺病毒载体疫苗AdH4的构建 | 第57-59页 |
| 2.3.2.1 穿梭质粒的构建 | 第57-58页 |
| 2.3.2.2 AdH4的鉴定 | 第58-59页 |
| 2.3.3 重组痘病毒载体疫苗MVAH4的构建 | 第59-61页 |
| 2.3.3.1 穿梭质粒的构建 | 第59-60页 |
| 2.3.3.2 MVAH4的鉴定 | 第60-61页 |
| 2.3.4 免疫原性检测 | 第61-67页 |
| 2.3.4.1 ELISA检测血清中的特异性抗体 | 第61-62页 |
| 2.3.4.2 ELISpot检测抗原特异性分泌IFN-γ 脾细胞 | 第62-63页 |
| 2.3.4.3 T细胞表面CD69分子的表达 | 第63-65页 |
| 2.3.4.4 CTL体外杀伤结果 | 第65-66页 |
| 2.3.4.5 细胞因子的分泌 | 第66-67页 |
| 2.4 讨论 | 第67-68页 |
| 2.5 小结 | 第68-70页 |
| 第三章t PA信号肽序列增强MVA载体重组结核疫苗的研究 | 第70-83页 |
| 3.1 实验材料 | 第70页 |
| 3.2 实验方法 | 第70-73页 |
| 3.2.1 获取t PA-Ag85B-TB10.4 融合基因 | 第70页 |
| 3.2.2 构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ag85B-TB10.4 | 第70-71页 |
| 3.2.3 验证t PA信号肽序列对于Ag85B-TB10.4抗原蛋白表达的影响 | 第71-72页 |
| 3.2.4 重组痘病毒载体结核疫苗MVATH4的构建 | 第72页 |
| 3.2.5 免疫方案 | 第72页 |
| 3.2.6 免疫原性检测 | 第72-73页 |
| 3.3 实验结果 | 第73-80页 |
| 3.3.1 tPA信号肽基因与Ag85B-TB10.4基因的融合 | 第73-74页 |
| 3.3.2 真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ag85B-TB10.4的构建 | 第74-75页 |
| 3.3.3 tPA信号肽序列对抗原蛋白表达的影响 | 第75页 |
| 3.3.4 重组MVATH4的鉴定 | 第75-76页 |
| 3.3.5 免疫原性检测 | 第76-80页 |
| 3.3.5.1 ELISA法检测特异性抗体应答 | 第76-77页 |
| 3.3.5.2 ELISpot检测分泌IFN-γ 的脾细胞 | 第77-78页 |
| 3.3.5.3 CD69的表达情况 | 第78-79页 |
| 3.3.5.4 细胞因子的分泌 | 第79-80页 |
| 3.4 讨论 | 第80-82页 |
| 3.5 小结 | 第82-83页 |
| 第四章 基于BLP技术的蛋白亚单位结核疫苗 | 第83-100页 |
| 4.1 实验材料 | 第83页 |
| 4.2 实验方法 | 第83-88页 |
| 4.2.1 抗原蛋白表达质粒的构建 | 第83-84页 |
| 4.2.2 Ag85B-PA和TB10.4-PA融合蛋白的表达 | 第84-85页 |
| 4.2.2.1 确定菌种 | 第84页 |
| 4.2.2.2 确定表达条件 | 第84-85页 |
| 4.2.3 Ag85B-PA和TB10.4 的蛋白的制备 | 第85-86页 |
| 4.2.3.1 Ag85B-PA和TB10.4 的蛋白的纯化 | 第85页 |
| 4.2.3.2 Ag85B-PA与TB10.4-PA蛋白的复性及浓缩 | 第85-86页 |
| 4.2.4 BLP的制备及浓度确定 | 第86页 |
| 4.2.5 Ag85B-PA和TB10.4-PA与BLP的结合及鉴定 | 第86-87页 |
| 4.2.6 免疫方案 | 第87-88页 |
| 4.2.6.1 滴鼻途径免疫 | 第87页 |
| 4.2.6.2 肌肉注射途径免疫 | 第87-88页 |
| 4.2.7 免疫原性检测 | 第88页 |
| 4.3 实验结果 | 第88-97页 |
| 4.3.1 Ag85B-PA和TB10.4-PA表达质粒的构建 | 第88-89页 |
| 4.3.2 Ag85B-PA和TB10.4-PA蛋白的表达与纯化 | 第89-92页 |
| 4.3.3 Ag85B-PA和TB10.4-PA与BLP的结合能力 | 第92页 |
| 4.3.4 免疫荧光验证Ag85B-PA和TB10.4-PA与BLP的结合 | 第92-93页 |
| 4.3.5 滴鼻途径免疫应答 | 第93-94页 |
| 4.3.6 肌肉注射途径免疫应答 | 第94-97页 |
| 4.3.6.1 ELISA法检测特异性抗体应答 | 第94-95页 |
| 4.3.6.2 ELISpot检测分泌IFN-γ 的脾细胞 | 第95-96页 |
| 4.3.6.3 细胞因子的分泌 | 第96-97页 |
| 4.4 讨论 | 第97-98页 |
| 4.5 小结 | 第98-100页 |
| 结论 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-112页 |
| 作者简介及攻读博士学位期间发表论文 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113页 |
