| 摘要 | 第8-10页 |
| 英文摘要 | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第12-31页 |
| 1.1 弓形虫病与弓形虫 | 第12-16页 |
| 1.1.1 弓形虫生活史 | 第12-13页 |
| 1.1.2 弓形虫病的传播及危害 | 第13-14页 |
| 1.1.3 弓形虫的致病机制概述 | 第14-15页 |
| 1.1.4 弓形虫病的预防与诊断 | 第15-16页 |
| 1.2 弓形虫与宿主细胞的关系 | 第16-26页 |
| 1.2.1 弓形虫感染引起的宿主天然免疫反应 | 第16页 |
| 1.2.2 顶复门原虫入侵宿主细胞分子机制研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2.3 入侵动力——滑行运动 | 第17-18页 |
| 1.2.4 弓形虫入侵相关蛋白研究进展 | 第18-22页 |
| 1.2.5 移动联结的分子结构基础研究进展 | 第22-26页 |
| 1.3 基因编辑技术在弓形虫中的应用 | 第26-30页 |
| 1.3.1 弓形虫中传统反向遗传技术 | 第26页 |
| 1.3.2 弓形虫中对于必须基因的研究策略 | 第26-29页 |
| 1.3.3 CRISPR-Cas9介导的基因编辑系统 | 第29-30页 |
| 1.4 研究目的与意义 | 第30-31页 |
| 2 材料与方法 | 第31-43页 |
| 2.1 试验材料 | 第31-35页 |
| 2.1.1 虫株、细胞与实验动物 | 第31页 |
| 2.1.2 菌株与载体 | 第31页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第31-32页 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 | 第32页 |
| 2.1.5 主要软件 | 第32-33页 |
| 2.1.6 本研究中使用的引物 | 第33-35页 |
| 2.2 试验方法 | 第35-43页 |
| 2.2.1 弓形虫的细胞内培养及纯化 | 第35页 |
| 2.2.2 弓形虫TgRON4、TgRON5多克隆抗体的制备 | 第35-38页 |
| 2.2.3 间接免疫荧光检测TgRON4、TgRON5蛋白在虫体中定位 | 第38页 |
| 2.2.4 利用CRISPR-Cas9系统构建弓形虫RON4基因缺失虫株 | 第38-40页 |
| 2.2.5 弓形虫基因组的提取 | 第40页 |
| 2.2.6 弓形虫Westen bolt检测 | 第40页 |
| 2.2.7 弓形虫入侵试验 | 第40页 |
| 2.2.8 弓形虫入侵能力检测-红绿双色染色法 | 第40-41页 |
| 2.2.9 弓形虫复制能力的检测 | 第41页 |
| 2.2.10 弓形虫逸出宿主细胞能力的检测 | 第41页 |
| 2.2.11 TgRON4基因补偿表达虫株的构建 | 第41-42页 |
| 2.2.12 RON4补偿表达虫株入侵能力的鉴定 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-59页 |
| 3.1 anti-TgRON4、anti-TgRON5多克隆血清制备及分析 | 第43-46页 |
| 3.1.1 TgRON4、TgRON5截短基因的克隆 | 第43-44页 |
| 3.1.2 pGEX-4T-3-TgRON4t、pGEX-4T-3-TgRON5t重组表达质粒的构建 | 第44-45页 |
| 3.1.3 TgRON4、TgRON5重组蛋白的原核表达和纯化 | 第45-46页 |
| 3.1.4 多克隆血清的Western blot分析 | 第46页 |
| 3.2 TgRON4、TgRON5在虫体中定位分析结果 | 第46-47页 |
| 3.3 构建TgRON4基因敲除质粒 | 第47-48页 |
| 3.3.1 TgRON4的gRNA靶序列的克隆 | 第47-48页 |
| 3.3.2 敲除质粒的鉴定 | 第48页 |
| 3.4 TgRON4基因缺失虫株的筛选及鉴定 | 第48-52页 |
| 3.4.1 TgRON4基因位点核苷酸突变鉴定 | 第49-50页 |
| 3.4.2 TgRON4蛋白缺失的鉴定 | 第50-52页 |
| 3.5 TgRON4基因的缺失导致MJ成员TgRON5蛋白表达水平受到影响 | 第52-53页 |
| 3.6 TgRON4基因缺失降低虫体对宿主细胞的入侵能力 | 第53-55页 |
| 3.7 TgRON4基因缺失对于虫体在宿主细胞内的复制能力没有影响 | 第55页 |
| 3.8 TgRON4基因缺失对于虫体逸出宿主细胞的能力没有影响 | 第55-57页 |
| 3.9 synoTgRON4基因补偿表达弓形虫的构建 | 第57-58页 |
| 3.9.1 pBluescript-synoTgRON4-HA质粒的构建结果 | 第57页 |
| 3.9.2 补偿表达TgRON4弓形虫株的构建及鉴定 | 第57-58页 |
| 3.10 补偿表达synoTgRON4基因恢复缺失虫株的入侵能力 | 第58-59页 |
| 4 讨论 | 第59-64页 |
| 4.1 TgRON4和TgRON5蛋白原核表达和多克隆抗体制备 | 第59-60页 |
| 4.2 运用CRISPR-Cas9敲除技术构建TgRON4基因缺失虫株 | 第60-61页 |
| 4.3 基因敲除TgRON4对弓形虫表型影响的分析 | 第61-63页 |
| 4.4 TgRON4基因缺失虫株中对MJ成员的影响 | 第63-64页 |
| 5 结论 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-80页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第80页 |
