| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 符号说明及縮写词表 | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-28页 |
| 1.1 瓜氨酸研究进展 | 第14-16页 |
| 1.1.1 瓜氨酸代谢 | 第14-16页 |
| 1.1.2 瓜氨酸的生产方法 | 第16页 |
| 1.2 精氨酸脱亚氨基酶的研究进展 | 第16-22页 |
| 1.2.1 精氨酸脱亚氨基酶的药理作用 | 第17-18页 |
| 1.2.2 精氨酸脱亚氨基酶的研究进展 | 第18-22页 |
| 1.3 外源基因在大肠杆菌中的异源表达 | 第22-25页 |
| 1.3.1 密码子优化 | 第23页 |
| 1.3.2 培养条件优化 | 第23页 |
| 1.3.3 分子伴侣 | 第23-24页 |
| 1.3.4 细胞分泌表达 | 第24-25页 |
| 1.3.5 融合表达技术 | 第25页 |
| 1.4 本论文ADI来源菌株概况 | 第25-26页 |
| 1.5 本论文开展思路及研究内容 | 第26-28页 |
| 第二章 三种ADI基因在大肠杆菌中异源表达 | 第28-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第28-33页 |
| 2.1.1 本论文使用的实验菌株及质粒 | 第28-29页 |
| 2.1.2 本论文所使用的培养基 | 第29-30页 |
| 2.1.3 本论文中主要的工具酶、试剂与试剂盒 | 第30页 |
| 2.1.4 本论文中主要溶液的配制 | 第30-32页 |
| 2.1.5 本论文所使用的仪器设备 | 第32-33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-41页 |
| 2.2.1 ADI氨基酸序列的比较分析 | 第33页 |
| 2.2.2 密码子优化 | 第33-34页 |
| 2.2.3 表达载体的构建 | 第34-39页 |
| 2.2.3.1 目的片段的PCR扩增 | 第34-35页 |
| 2.2.3.2 PCR产物的切胶回收 | 第35-36页 |
| 2.2.3.3 连接pEASY-Blunt Simple Cloning Vector | 第36-37页 |
| 2.2.3.4 PCR方法鉴定阳性重组子 | 第37页 |
| 2.2.3.5 质粒载体的酶切及连接 | 第37-39页 |
| 2.2.3.6 连接产物转化克隆宿主 | 第39页 |
| 2.2.4 目的蛋白的诱导培养 | 第39-41页 |
| 2.2.5 rADI活性检测 | 第41页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第41-45页 |
| 2.3.1 三种ADI的氨基酸序列分析 | 第41-43页 |
| 2.3.2 密码子优化 | 第43页 |
| 2.3.3 表达载体的构建 | 第43-44页 |
| 2.3.4 rTADI、rPADI及rLADI的异源表达 | 第44-45页 |
| 2.4 本章小结 | 第45-46页 |
| 第三章 促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法 | 第46-56页 |
| 3.1 实验菌株及质粒 | 第46页 |
| 3.2 实验方法 | 第46-48页 |
| 3.2.1 分子伴侣共表达 | 第46-47页 |
| 3.2.2 添加D-葡萄糖和L-精氨酸进行诱导表达 | 第47页 |
| 3.2.3 重组菌体总活力检测 | 第47-48页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第48-54页 |
| 3.3.1 分子伴侣共表达 | 第48-49页 |
| 3.3.2 添加D-葡萄糖和L-精氨酸进行诱导表达 | 第49-54页 |
| 3.4 本章小结 | 第54-56页 |
| 第四章 rTADI、rPADI与rLADI的纯化及酶学性质研究 | 第56-76页 |
| 4.1 实验菌株及质粒 | 第56页 |
| 4.2 实验方法 | 第56-61页 |
| 4.2.1 目的蛋白的诱导表达 | 第56-57页 |
| 4.2.2 水溶性蛋白的纯化 | 第57页 |
| 4.2.3 包涵体的体外复性 | 第57页 |
| 4.2.4 镍柱亲和层析纯化目的蛋白 | 第57-58页 |
| 4.2.5 蛋白浓度的测定 | 第58页 |
| 4.2.6 目的蛋白的透析 | 第58-59页 |
| 4.2.6.1 透析袋的预处理 | 第58页 |
| 4.2.6.2 透析 | 第58-59页 |
| 4.2.7 酶学性质研究 | 第59-61页 |
| 4.2.7.1 绘制L-瓜氨酸标准曲线 | 第59页 |
| 4.2.7.2 最适温度及热稳定性测定 | 第59-60页 |
| 4.2.7.3 最适pH及pH稳定性测定 | 第60页 |
| 4.2.7.4 金属离子及化学试剂对rADI活性的影响 | 第60页 |
| 4.2.7.5 动力学常数的测定 | 第60-61页 |
| 4.2.7.6 测定粗酶液的L-瓜氨酸转化率 | 第61页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第61-74页 |
| 4.3.1 rPADI、rLADI蛋白的纯化 | 第61-62页 |
| 4.3.2 rTADI蛋白的纯化 | 第62-65页 |
| 4.3.2.1 rTADI的截短表达 | 第62-64页 |
| 4.3.2.2 rTADI的体外复性 | 第64-65页 |
| 4.3.3 重组酶的性质研究 | 第65-74页 |
| 4.3.3.1 L-瓜氨酸标准曲线 | 第66页 |
| 4.3.3.2 蛋白浓度标准曲线 | 第66页 |
| 4.3.3.3 温度对rPADI及rLADI活性的影响 | 第66-68页 |
| 4.3.3.4 pH对rPADI及rLADI活性的影响 | 第68-70页 |
| 4.3.3.5 金属离子及化学试剂对rPADI及rLADI活性的影响 | 第70-72页 |
| 4.3.3.6 动力学常数的测定 | 第72-73页 |
| 4.3.3.7 测定rPADI粗酶液的L-瓜氨酸转化率 | 第73-74页 |
| 4.4 本章小结 | 第74-76页 |
| 总结与展望 | 第76-78页 |
| 附录一序列信息 | 第78-81页 |
| 1 TADI基因的密码子优化序列 | 第78-79页 |
| 2 PADI基因的密码子优化序列 | 第79-80页 |
| 3 LADI基因的密码子优化序列 | 第80-81页 |
| 附录二不同pH缓冲液的配制 | 第81-82页 |
| 附录三表达载体图谱信息 | 第82-88页 |
| 1 表达载体pBAD/gⅢA载体图谱及特征 | 第82-83页 |
| 2 表达载体pET-30a(+)载体图谱及特征 | 第83-84页 |
| 3 表达载体pET-15b载体图谱及特征 | 第84-85页 |
| 4 表达载体pColdTF载体图谱及其特征 | 第85-86页 |
| 5 表达载体pGEX-6P-1载体图谱及特征 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-94页 |
| 致谢 | 第94-96页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第96-97页 |
| 学位论文评闻及答辩情况表 | 第97页 |
