| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略词 | 第14-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-21页 |
| 1.1 结核病的概述 | 第15-16页 |
| 1.1.1 病原 | 第15页 |
| 1.1.2 结核病的流行病学 | 第15-16页 |
| 1.1.3 发病症状及病理特征 | 第16页 |
| 1.2 牛结核病的诊断方法 | 第16-20页 |
| 1.2.1 临床诊断 | 第16-17页 |
| 1.2.2 涂片镜检法 | 第17页 |
| 1.2.3 细菌分离培养法 | 第17页 |
| 1.2.4 分子生物学检测 | 第17页 |
| 1.2.5 结核菌素皮内变态反应试验 | 第17页 |
| 1.2.6 酶联免疫吸附试验 | 第17页 |
| 1.2.7 IFN-γ释放试验 | 第17-20页 |
| 1.2.7.1 IFN-γ研究综述 | 第18页 |
| 1.2.7.2 IFN-γ释放试验原理 | 第18页 |
| 1.2.7.3 IFN-γ释放试验检测检测牛结核特异性刺激原的选择 | 第18-19页 |
| 1.2.7.4 IFN-γ释放试验在诊断牛结核中的应用 | 第19页 |
| 1.2.7.5 IFN-γ释放试验的前景 | 第19-20页 |
| 1.3 研究的目的意义 | 第20-21页 |
| 第二章 BovIFN-γ的克隆、表达与纯化和抗BovIFN-γ单克隆抗体的制备 | 第21-39页 |
| 2.1 材料及试剂 | 第21-23页 |
| 2.1.1 菌株、载体、细胞和实验动物 | 第21页 |
| 2.1.2 主要试剂及药品 | 第21页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第21页 |
| 2.1.4 细菌及细胞培养基的配制 | 第21-22页 |
| 2.1.5 抗生素及IPTG的配制 | 第22页 |
| 2.1.6 SDS-PAGE、Western-blot及ELISA缓冲液的配制 | 第22-23页 |
| 2.2 BovIFN-γ的克隆、表达与纯化 | 第23-27页 |
| 2.2.1 引物设计与合成 | 第23页 |
| 2.2.2 外周血单核细胞的分离培养、诱导及总RNA的提取 | 第23页 |
| 2.2.3 RT-PCR扩增cDNA | 第23页 |
| 2.2.4 PCR扩增BovIFN | 第23页 |
| 2.2.5 PCR产物及载体的酶切、胶回收和连接 | 第23-24页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| 2.2.7 连接产物的转化 | 第25页 |
| 2.2.8 重组质粒p30b-BovIFN的酶切鉴定及测序 | 第25-26页 |
| 2.2.9 目的蛋白的诱导表达 | 第26页 |
| 2.2.10 目的蛋白的大量表达 | 第26页 |
| 2.2.11 目的蛋白的纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.12 目的蛋白的Western-blot鉴定 | 第27页 |
| 2.3 抗BovIFN-γ,单克隆抗体的制备 | 第27-32页 |
| 2.3.1 制备单克隆抗体的技术路线 | 第27-29页 |
| 2.3.2 动物免疫 | 第29页 |
| 2.3.2.1 重组蛋白免疫程序 | 第29页 |
| 2.3.2.2 抗原最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定 | 第29页 |
| 2.3.3 SP2/0骨髓瘤细胞的活化及制备 | 第29页 |
| 2.3.4 细胞融合 | 第29-30页 |
| 2.3.5 间接ELISA检测杂交瘤细胞上清中抗体效价 | 第30-31页 |
| 2.3.6 阳性杂交瘤细胞的克隆化 | 第31页 |
| 2.3.7 IFA检测单克隆杂交瘤细胞上清 | 第31页 |
| 2.3.8 阳性杂交瘤细胞的冻存 | 第31-32页 |
| 2.3.9 单克隆抗体腹水的生产 | 第32页 |
| 2.3.10 辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体 | 第32页 |
| 2.4 结果及分析 | 第32-38页 |
| 2.4.1 BovIFN-γ的克隆、表达与纯化 | 第32-35页 |
| 2.4.1.1 目的片段BovIFN-γ基因扩增产物分析 | 第32-33页 |
| 2.4.1.2 重组质粒p30b-BovIFN的酶切鉴定及测序分析 | 第33页 |
| 2.4.1.3 用亲和层析法对目的蛋白进行纯化结果 | 第33-34页 |
| 2.4.1.4 目的蛋白的Western-blot分析 | 第34-35页 |
| 2.4.2 抗BovIFN-γ单克隆抗体的制备 | 第35-38页 |
| 2.4.2.1 抗原最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定 | 第35页 |
| 2.4.2.2 免疫小鼠血清效价的检测 | 第35-36页 |
| 2.4.2.3 细胞融合后的观察 | 第36页 |
| 2.4.2.4 间接ELISA及IFA检测细胞株及阳性细胞株的建立 | 第36-37页 |
| 2.4.2.5 单克隆抗体的纯化 | 第37-38页 |
| 2.5 讨论 | 第38-39页 |
| 第三章 pCA-Sr-IFN质粒的构建及抗BovIFN-γ单克隆抗体的制备 | 第39-49页 |
| 3.1 材料及试剂 | 第39页 |
| 3.2 pCA-Sr-IFN质粒的构建 | 第39-41页 |
| 3.2.1 引物设计与合成 | 第39页 |
| 3.2.2 RAW细胞基因组的提取 | 第39页 |
| 3.2.3 鼠源信号肽Sr的PCR扩增 | 第39页 |
| 3.2.4 重叠PCR扩增Sr-IFN基因片段与胶回收 | 第39-40页 |
| 3.2.5 Sr-IFN基因片段及pCAGGS载体的酶切、胶回收和连接 | 第40页 |
| 3.2.6 连接产物的转化 | 第40页 |
| 3.2.7 重组质粒的双酶切鉴定及测序 | 第40-41页 |
| 3.2.8 中提去内毒素pCA-Sr-IFN质粒 | 第41页 |
| 3.3 抗BovIFN-γ单克隆抗体的制备 | 第41-42页 |
| 3.3.1 质粒pCA-Sr-IFN免疫程序 | 第41页 |
| 3.3.2 细胞融合 | 第41-42页 |
| 3.3.3 IFA检测杂交瘤细胞上清 | 第42页 |
| 3.3.4 阳性杂交瘤细胞的克隆化、腹水的生产及单克隆抗体的常规验证 | 第42页 |
| 3.4 结果及分析 | 第42-45页 |
| 3.4.1 pCA-Sr-IFN质粒的构建 | 第42-43页 |
| 3.4.1.1 信号肽Sr基因扩增产物分析 | 第42页 |
| 3.4.1.2 Sr-IFN基因的扩增产物分析 | 第42-43页 |
| 3.4.1.3 重组质粒pCA-Sr-IFN的酶切鉴定及测序分析 | 第43页 |
| 3.4.2 抗BovIFN-γ单克隆抗体的制备 | 第43-45页 |
| 3.4.2.1 质粒免疫小鼠效价的检测 | 第43-44页 |
| 3.4.2.2 IFA检测杂交瘤细胞上清及阳性细胞株的建立 | 第44-45页 |
| 3.4.2.3 单克隆抗体的纯化 | 第45页 |
| 3.5 讨论 | 第45-49页 |
| 3.5.1 CHO细胞及信号肽的选择 | 第45-46页 |
| 3.5.2 小鼠免疫 | 第46页 |
| 3.5.3 细胞融合 | 第46-47页 |
| 3.5.4 筛选方法的建立 | 第47页 |
| 3.5.5 杂交瘤细胞的克隆化 | 第47页 |
| 3.5.6 操作过程中的污染和控制 | 第47-49页 |
| 第四章 抗BovIFN-γ单克隆抗体的特性研究 | 第49-56页 |
| 4.1 材料及试剂 | 第49页 |
| 4.2 方法 | 第49-51页 |
| 4.2.1 单克隆抗体亚类的测定 | 第49页 |
| 4.2.2 Western-blot法检测单克隆抗体的反应特性 | 第49-50页 |
| 4.2.3 单克隆抗体相对亲和力的测定 | 第50页 |
| 4.2.4 单克隆抗体抗原表位分析 | 第50页 |
| 4.2.5 杂交瘤细胞染色体数的检测(秋水仙素裂解法) | 第50页 |
| 4.2.6 酶标抗体的制备 | 第50-51页 |
| 4.2.7 抗体酶标效果的检测 | 第51页 |
| 4.2.8 初步夹心ELISA试验 | 第51页 |
| 4.3 结果及分析 | 第51-55页 |
| 4.3.1 单克隆抗体亚类的鉴定 | 第51页 |
| 4.3.2 Western-blot法检测单克隆抗体的反应特性 | 第51-52页 |
| 4.3.3 单克隆抗体相对亲和力的测定 | 第52-53页 |
| 4.3.4 单克隆抗体抗原表位分析 | 第53页 |
| 4.3.5 杂交瘤细胞稳定性和染色体数的检测 | 第53页 |
| 4.3.6 抗体酶标效果的检测 | 第53-54页 |
| 4.3.7 初步夹心ELISA试验 | 第54-55页 |
| 4.4 讨论 | 第55-56页 |
| 第五章 全文结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 作者简历 | 第62页 |
