| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-29页 |
| 1.1 抗肿瘤药物基于靶点的分类 | 第10-18页 |
| 1.1.1 肿瘤细胞特异性的靶点 | 第10-11页 |
| 1.1.2 非特异性靶点 | 第11-18页 |
| 1.2 氨基酸与肿瘤 | 第18-22页 |
| 1.2.1 氨基酸不平衡法治疗肿瘤 | 第18-19页 |
| 1.2.2 Leu 参加mTOR 信号转导途径 | 第19-21页 |
| 1.2.3 Leu-mTOR 途径与肿瘤 | 第21-22页 |
| 1.3 氨酰t-RNA 合成酶作为抗肿瘤的靶点 | 第22-27页 |
| 1.3.1 氨酰t-RNA 合成酶的分类 | 第22-24页 |
| 1.3.2 氨酰t-RNA 合成酶的功能 | 第24-25页 |
| 1.3.3 氨酰t-RNA 合成酶作为潜在的抗肿瘤的靶点 | 第25-26页 |
| 1.3.4 氨酰tRNA 合成酶作为抗肿瘤药物靶点的研究现状 | 第26-27页 |
| 1.4 课题意义及研究内容 | 第27-29页 |
| 第二章 人源性亮氨酰tRNA 合成酶的克隆、表达、纯化及活性测定 | 第29-44页 |
| 2.1 导言 | 第29页 |
| 2.2 材料及仪器 | 第29-31页 |
| 2.2.1 质粒及菌株 | 第29-30页 |
| 2.2.2 酶、主要试剂 | 第30-31页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第31页 |
| 2.3 实验方法 | 第31-37页 |
| 2.3.1 DNA 的琼脂糖电泳 | 第31页 |
| 2.3.2 PCR 产物割胶回收 | 第31-32页 |
| 2.3.3 转化 | 第32页 |
| 2.3.4 质粒抽提 | 第32-33页 |
| 2.3.5 HOSE 细胞中提取总的RNA | 第33页 |
| 2.3.6 RNA 逆转录（Reverse Transcription， RT） | 第33-34页 |
| 2.3.7 PCR 扩增目的基因 | 第34页 |
| 2.3.8 人源亮氨酰tRNA 合成酶表达质粒的构建 | 第34页 |
| 2.3.9 重组菌的小量诱导 | 第34-35页 |
| 2.3.10 重组蛋白的大量表达 | 第35页 |
| 2.3.11 重组蛋白的纯化 | 第35-36页 |
| 2.3.12 免疫印迹 | 第36页 |
| 2.3.13 酶活性分析 | 第36-37页 |
| 2.4 实验结果 | 第37-42页 |
| 2.4.1 人源性亮氨酰tRNA 合成酶重组质粒构建原理 | 第37-38页 |
| 2.4.2 重组表达质粒pET21a-hLeuRS-N/C-His 的构建 | 第38-39页 |
| 2.4.3 融合蛋白的表达及纯化 | 第39-40页 |
| 2.4.4 免疫印迹分析 | 第40-41页 |
| 2.4.5 酶活性的测定 | 第41-42页 |
| 2.5 讨论和小结 | 第42-44页 |
| 第三章 亮氨酰-tRNA 合成酶抑制剂的筛选 | 第44-55页 |
| 3.1 导言 | 第44-45页 |
| 3.2 材料及仪器 | 第45-46页 |
| 3.2.1 质粒和细胞 | 第45页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第45页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第45-46页 |
| 3.3 实验方法 | 第46-48页 |
| 3.3.1 同源序列比对 | 第46页 |
| 3.3.2 酶学水平上抑制剂的筛选 | 第46页 |
| 3.3.3 候选化合物对U2OS 细胞和SKOV3 细胞增殖抑制作用 | 第46-47页 |
| 3.3.4 化合物No.1，No.32 对U2OS 细胞的生长抑制 | 第47页 |
| 3.3.5 化合物No.32 对EMT6 和3T3 细胞的生长抑制 | 第47-48页 |
| 3.3.6 数据处理 | 第48页 |
| 3.4 实验结果 | 第48-54页 |
| 3.4.1 体外小分子抑制剂选择的原理 | 第48-49页 |
| 3.4.2 体外酶学水平对小分子抑制剂的筛选 | 第49-50页 |
| 3.4.3 体外细胞水平对小分子抑制剂的筛选 | 第50-51页 |
| 3.4.4 待选抑制剂的分类 | 第51页 |
| 3.4.5 选定的小分子抑制剂可以抑制肿瘤细胞生长 | 第51-52页 |
| 3.4.6 抑制剂对肿瘤细胞的生长抑制比正常细胞的生长抑制敏感 | 第52-54页 |
| 3.5 讨论与小结 | 第54-55页 |
| 第四章 亮氨酰tRNA 合成酶作为抑制剂在细胞内的靶点 | 第55-66页 |
| 4.1 导言 | 第55页 |
| 4.2 材料及仪器 | 第55-56页 |
| 4.2.1 质粒和细胞 | 第55-56页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第56页 |
| 4.2.3 主要仪器 | 第56页 |
| 4.3 实验方法 | 第56-58页 |
| 4.3.1 亮氨酰tRNA 合成酶真核表达载体的构建 | 第56-57页 |
| 4.3.2 细胞培养 | 第57页 |
| 4.3.3 PEI 介导重组质粒转染 | 第57页 |
| 4.3.4 质粒转染法进行靶点初步确定 | 第57-58页 |
| 4.3.5 浓度梯度质粒转染进一步确定靶点 | 第58页 |
| 4.3.6 免疫印迹 | 第58页 |
| 4.4 实验结果 | 第58-65页 |
| 4.4.1 亮氨酰tRNA 合成酶真核表达载体的构建 | 第58-60页 |
| 4.4.2 建立靶点确认体系 | 第60-63页 |
| 4.4.3 确认亮氨酰tRNA 合成酶作为抑制剂在细胞内作用的靶点 | 第63-65页 |
| 4.5 讨论与小结 | 第65-66页 |
| 第五章 亮氨酰tRNA 作为靶点的作用机制 | 第66-80页 |
| 5.1 导言 | 第66页 |
| 5.2 材料及仪器 | 第66-67页 |
| 5.2.1 质粒和细胞 | 第66-67页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第67页 |
| 5.2.3 主要仪器 | 第67页 |
| 5.3 实验方法 | 第67-69页 |
| 5.3.1 细胞形态学观察 | 第67页 |
| 5.3.2 DAPI 染色判断调亡差异 | 第67-68页 |
| 5.3.3 流式细胞仪检测 | 第68页 |
| 5.3.4 瞬时转染实验及荧光素酶报告基因的检测 | 第68-69页 |
| 5.3.5 肿瘤移植实验 | 第69页 |
| 5.3.6 数据处理 | 第69页 |
| 5.4 实验结果 | 第69-78页 |
| 5.4.1 对亮氨酰tRNA 合成酶的抑制可以诱导细胞凋亡 | 第69-73页 |
| 5.4.2 对亮氨酰tRNA 合成酶的抑制可以使细胞周期停滞在G0/G1 期 | 第73-74页 |
| 5.4.3 对亮氨酰tRNA 合成酶的抑制可以调控p21 启动子的转录活性 | 第74-76页 |
| 5.4.4 对肿瘤生长的影响 | 第76-77页 |
| 5.4.5 血清影响抑制剂对细胞的凋亡作用 | 第77-78页 |
| 5.5 讨论和小结 | 第78-80页 |
| 第六章 全文总结 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-85页 |
| 符号说明（附录1） | 第85-87页 |
| 试剂配方（附录2） | 第87-92页 |
| 附录一：蛋白表达纯化过程中所用试剂 | 第87-89页 |
| 附录二：免疫印迹试剂的配制 | 第89-91页 |
| 附录三：细胞实验所用试剂 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-94页 |
| 攻读硕士学位期间已发表的论文及申请专利 | 第94-97页 |
| 已发表论文 | 第94页 |
| 申请发明专利 | 第94-97页 |
| 上海交通大学硕士学位论文答辩决议书 | 第97页 |
