| 摘要 | 第8-11页 |
| Abstract | 第11-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-31页 |
| 1.1 糖尿病及其危害 | 第17-20页 |
| 1.1.1 Ⅰ型糖尿病 | 第17-18页 |
| 1.1.2 Ⅱ型糖尿病 | 第18页 |
| 1.1.3 其它特异性糖尿病 | 第18-19页 |
| 1.1.4 妊娠期糖尿病 | 第19页 |
| 1.1.5 目前糖尿病发病特点 | 第19-20页 |
| 1.1.6 糖尿病治疗 | 第20页 |
| 1.2 胰岛素及其相关研究 | 第20-25页 |
| 1.2.1 胰岛素组成 | 第20-21页 |
| 1.2.2 胰岛素结构 | 第21-22页 |
| 1.2.3 胰岛素研究沿革 | 第22-23页 |
| 1.2.4 胰岛素体内合成 | 第23-24页 |
| 1.2.5 胰岛素功能 | 第24页 |
| 1.2.6 胰岛素类型 | 第24-25页 |
| 1.3 重组人胰岛素类似物 | 第25-28页 |
| 1.3.1 重组人胰岛素类似物应用 | 第25-26页 |
| 1.3.2 重组人胰岛素类似物分类 | 第26-28页 |
| 1.3.2.1 长效人胰岛素类似物 | 第26-27页 |
| 1.3.2.2 速效人胰岛素类似物 | 第27-28页 |
| 1.4 基因工程胰岛素 | 第28-30页 |
| 1.4.1 微生物表达系统 | 第28-29页 |
| 1.4.2 动物表达系统 | 第29页 |
| 1.4.3 植物表达系统 | 第29-30页 |
| 1.5 本论文研究意义 | 第30-31页 |
| 第二章 材料与方法 | 第31-52页 |
| 2.1 材料 | 第31-35页 |
| 2.1.1 菌种与载体 | 第31页 |
| 2.1.2 主要生化试剂 | 第31-34页 |
| 2.1.3 细菌培养基 | 第34页 |
| 2.1.4 抗生素配制 | 第34页 |
| 2.1.5 动物实验器材及试剂 | 第34-35页 |
| 2.2 实验方法 | 第35-52页 |
| 2.2.1 速效人胰岛素原类似物基因设计与合成 | 第35-38页 |
| 2.2.1.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备和转化 | 第37-38页 |
| 2.2.1.2 阳性克隆检测 | 第38页 |
| 2.2.2 原核表达载体的构建 | 第38-42页 |
| 2.2.2.1 质粒抽提和酶切 | 第38-40页 |
| 2.2.2.2 表达载体构建 | 第40页 |
| 2.2.2.3 大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备 | 第40-41页 |
| 2.2.2.4 转化大肠杆菌BL21（DE3） | 第41页 |
| 2.2.2.5 阳性克隆的检测 | 第41-42页 |
| 2.2.3 速效人胰岛原类似物的诱导表达 | 第42-49页 |
| 2.2.3.1 蛋白电泳 | 第42-46页 |
| 2.2.3.2 IPTG 诱导原核高表达菌株的筛选和诱导时间优化 | 第46-47页 |
| 2.2.3.3 目标蛋白可溶性分析 | 第47-48页 |
| 2.2.3.4 Western-blot 分析 | 第48-49页 |
| 2.2.4 速效胰岛素原类似物蛋白纯化 | 第49页 |
| 2.2.5 蛋白浓度测定 | 第49页 |
| 2.2.5.1 标准曲线绘制 | 第49页 |
| 2.2.5.2 靶蛋白浓度检测 | 第49页 |
| 2.2.6 包涵体蛋白复性 | 第49-50页 |
| 2.2.6.1 复性缓冲液配制 | 第50页 |
| 2.2.6.2 包涵体蛋白复性 | 第50页 |
| 2.2.7 速效胰岛素原的酶解和质谱检测 | 第50-51页 |
| 2.2.7.1 速效胰岛素原复性和酶切 | 第50页 |
| 2.2.7.2 速效胰岛素质谱检测 | 第50-51页 |
| 2.2.8 速效人胰岛素类似物蛋白小鼠降血糖实验 | 第51-52页 |
| 2.2.8.1 实验方法 | 第51-52页 |
| 2.2.8.2 实验数据处理 | 第52页 |
| 第三章 结果分析 | 第52-77页 |
| 3.1 靶基因的设计与合成 | 第52-55页 |
| 3.2 原核表达载体构建 | 第55-60页 |
| 3.3 速效胰岛素原蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 | 第60-64页 |
| 3.3.1 速效胰岛素原的诱导表达 | 第60页 |
| 3.3.2 IPTG 诱导时间的优化 | 第60-61页 |
| 3.3.3 速效胰岛素原蛋白可溶性分析 | 第61-62页 |
| 3.3.4 靶蛋白Western-blot 分析 | 第62-64页 |
| 3.4 速效胰岛素原类似物纯化 | 第64-65页 |
| 3.5 纯化后胰岛素原蛋白浓度测定 | 第65-66页 |
| 3.6 重组人胰岛素原复性 | 第66-67页 |
| 3.7 速效胰岛素原蛋白酶切和检测 | 第67-73页 |
| 3.7.1 速效胰岛素原酶解流程 | 第67-68页 |
| 3.7.2 酶切条件的探索 | 第68-71页 |
| 3.7.3 酶切产物Western-blot 检测 | 第71-72页 |
| 3.7.4 速效胰岛素的质谱分析 | 第72-73页 |
| 3.8 速效胰岛物类似物生物学活性 | 第73-77页 |
| 第四章 讨论与小结 | 第77-81页 |
| 4.1 讨论 | 第77-78页 |
| 4.1.1 按植物偏爱密码子设计合成基因意图 | 第77页 |
| 4.1.2 包涵体蛋白复性条件优化 | 第77-78页 |
| 4.1.3 胰岛素原酶切反应条件还有待优化 | 第78页 |
| 4.2 本工作创新点 | 第78页 |
| 4.3 小结 | 第78-79页 |
| 4.4 后续工作展望 | 第79-81页 |
| 4.4.1 提高酶切产物纯度 | 第79页 |
| 4.4.2 利用植物生物反应器表达重组人胰岛素类似物蛋白 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-91页 |
| 致谢 | 第91-93页 |
| 附录 | 第93-95页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文和申请专利 | 第95-97页 |
| 上海交通大学学位论文答辩决议书 | 第97-98页 |
