| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7页 |
| 第一章 引言 | 第13-21页 |
| 1.1 淀粉与淀粉酶 | 第13-16页 |
| 1.1.1 淀粉 | 第13页 |
| 1.1.2 α-淀粉酶 | 第13-14页 |
| 1.1.3 淀粉糖的制作工艺与高温耐酸 α-淀粉酶 | 第14-16页 |
| 1.2 耐高温 α-淀粉酶的研究进展 | 第16-19页 |
| 1.2.1 耐高温 α-淀粉酶BLA | 第16-17页 |
| 1.2.2 耐高温 α-淀粉酶BLA在E.coli中表达 | 第17-18页 |
| 1.2.3 耐高温 α-淀粉酶BLA的结构 | 第18-19页 |
| 1.3 淀粉酶的优化改造 | 第19-20页 |
| 1.4 本研究的目的与意义 | 第20-21页 |
| 第二章 高温 α-淀粉酶酸稳定性相关突变体设计 | 第21-39页 |
| 2.1 实验材料与方法 | 第21-24页 |
| 2.1.1 实验仪器 | 第21页 |
| 2.1.2 工具酶及引物 | 第21-22页 |
| 2.1.3 试剂和试剂盒 | 第22页 |
| 2.1.4 实验菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.1.5 培养基 | 第22-23页 |
| 2.1.6 溶液 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-33页 |
| 2.2.1 重组质粒pET22b (+)-bla的构建 | 第24-26页 |
| 2.2.1.1 pET22b (+)载体的线性化 | 第24页 |
| 2.2.1.2 重组质粒构建的第一步PCR | 第24-25页 |
| 2.2.1.3 重组质粒构建的第二步PCR | 第25-26页 |
| 2.2.2 大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态制备及转化 | 第26-27页 |
| 2.2.3 阳性克隆的鉴定 | 第27页 |
| 2.2.4 三种 α-淀粉酶BLA、BAA、PFA氨基酸序列比对分析 | 第27页 |
| 2.2.5 重组质粒pET22b(+)-bla突变体的构建 | 第27-30页 |
| 2.2.6 大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态制备及转化 | 第30页 |
| 2.2.7 重组质粒突变体阳性菌株的鉴定 | 第30页 |
| 2.2.8 重组蛋白在大肠杆菌中的异源表达 | 第30页 |
| 2.2.9 大肠杆菌重组蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.10 α-淀粉酶BLA活性及性质测定方法 | 第31-33页 |
| 2.2.10.1 葡萄糖标准曲线的绘制 | 第31-32页 |
| 2.2.10.2 BLA及其突变体最适pH的测定及pH稳定性的测定 | 第32页 |
| 2.2.10.3 BLA及其突变体动力学参数的测定 | 第32页 |
| 2.2.10.4 BLA及其突变体Tm值测定 | 第32-33页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第33-37页 |
| 2.3.1 BLA、BAA、PFA的比对结果 | 第33-34页 |
| 2.3.2 验证突变位点Q264对BLA最适pH及酸稳定性的影响 | 第34-36页 |
| 2.3.2.1 Q264突变体及野生型BLAs的最适pH | 第35页 |
| 2.3.2.2 Q264突变体及野生型BLAs的pH稳定性 | 第35-36页 |
| 2.3.3 Q264突变体及野生型BLAs动力学参数 | 第36-37页 |
| 2.3.4 野生型及突变体的BLAs的Tm值 | 第37页 |
| 2.4 讨论 | 第37-38页 |
| 2.5 本章小结 | 第38-39页 |
| 第三章 高温 α-淀粉酶热稳定性相关突变体的设计 | 第39-46页 |
| 3.1 实验材料 | 第39-40页 |
| 3.1.1 实验菌株及质粒 | 第39页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第39页 |
| 3.1.3 工具酶及引物 | 第39页 |
| 3.1.4 培养基及溶液 | 第39-40页 |
| 3.1.5 试剂及试剂盒 | 第40页 |
| 3.2 实验方法 | 第40-41页 |
| 3.2.1 对 α-淀粉酶BLA二级结构及序列分析 | 第40页 |
| 3.2.2 重组质粒pET22b(+)-bla的构建 | 第40页 |
| 3.2.3 定点突变 | 第40页 |
| 3.2.4 重组蛋白表达与纯化 | 第40页 |
| 3.2.5 BLA及其突变体热稳定性测定 | 第40页 |
| 3.2.6 野生型BLA及其突变体Tm值的测定 | 第40页 |
| 3.2.7 野生型BLA及其突变体动力学参数的测定 | 第40-41页 |
| 3.3 结果与分析 | 第41-44页 |
| 3.3.1 α-淀粉酶BLA二级结构及序列分析 | 第41页 |
| 3.3.2 α-淀粉酶BLA及其突变体的热稳定性 | 第41-43页 |
| 3.3.3 野生型BLA及其突变体Tm值测定 | 第43-44页 |
| 3.3.4 α-淀粉酶BLA及其突变体的动力学参数 | 第44页 |
| 3.4 讨论 | 第44-45页 |
| 3.5 本章小结 | 第45-46页 |
| 第四章 α-淀粉酶在大肠杆菌中可溶性表达相关突变体的设计 | 第46-59页 |
| 4.1 实验材料 | 第46-47页 |
| 4.1.1 实验菌株及质粒 | 第46页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第46页 |
| 4.1.3 工具酶及引物 | 第46-47页 |
| 4.1.4 培养基及溶液 | 第47页 |
| 4.1.5 试剂及试剂盒 | 第47页 |
| 4.2 实验方法 | 第47-48页 |
| 4.2.1 重组质粒pET22b (+)-bla的构建 | 第47页 |
| 4.2.2 随机突变及BLA突变体的筛选 | 第47-48页 |
| 4.2.3 计算机模拟分析突变位点390和 401 | 第48页 |
| 4.2.4 野生型BLA及其突变体动力学参数的测定 | 第48页 |
| 4.2.5 定点突变 | 第48页 |
| 4.2.6 野生型BLA及其突变体Tm值的测定 | 第48页 |
| 4.3 结果与分析 | 第48-57页 |
| 4.3.1 BLA随机突变体库的筛选 | 第48-50页 |
| 4.3.2 野生型BLA及其突变体的结构分析 | 第50-51页 |
| 4.3.3 α-淀粉酶BLA的定点突变 | 第51-53页 |
| 4.3.4 可溶性BLA蛋白的表达分析 | 第53-54页 |
| 4.3.5 野生型BLA及突变型BLAs的结构模拟 | 第54-57页 |
| 4.4 讨论 | 第57-58页 |
| 4.5 本章小结 | 第58-59页 |
| 第五章 全文结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 附录 | 第65-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 作者简历 | 第68页 |
