| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-22页 |
| 1.1 引言 | 第12页 |
| 1.2 蒸馏酒的概述 | 第12-13页 |
| 1.3 白酒的生产方法 | 第13-16页 |
| 1.3.1 液态发酵方法 | 第13-15页 |
| 1.3.2 半固态发酵方法 | 第15页 |
| 1.3.3 固态发酵方法 | 第15-16页 |
| 1.4 蒸馏酒中高级醇的概述 | 第16-18页 |
| 1.4.1 蒸馏酒中的高级醇与危害 | 第16页 |
| 1.4.2 蒸馏酒中高级醇形成的机理 | 第16-18页 |
| 1.5 酵母菌遗传操作方法 | 第18-20页 |
| 1.5.1 化学诱变 | 第18页 |
| 1.5.2 物理诱变 | 第18-19页 |
| 1.5.3 原生质体融合育种 | 第19页 |
| 1.5.4 基因工程育种 | 第19-20页 |
| 1.6 编码异戊醇合成的相关酶系基因的研究 | 第20页 |
| 1.7 酒中异戊醇及高级醇的测定方法 | 第20-21页 |
| 1.7.1 高效液相色谱法 | 第20-21页 |
| 1.7.2 气相色谱法 | 第21页 |
| 1.7.3 单粒子检测法 | 第21页 |
| 1.8 本课题研究的目的与意义 | 第21-22页 |
| 第二章 构建THI3基因缺失酵母菌 | 第22-43页 |
| 2.1 前言 | 第22页 |
| 2.2 材料与仪器 | 第22-24页 |
| 2.2.1 实验菌种 | 第22页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.3 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 2.2.4 主要溶液的配置 | 第24页 |
| 2.2.5 主要培养基的配置 | 第24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-32页 |
| 2.3.1 本实验参照Cre-Loxp重组酶系统的酿酒酵母基因敲除方法的原理 | 第24-25页 |
| 2.3.2 提取酿酒酵母的基因组 | 第25-26页 |
| 2.3.3 PCR验证酿酒酵母中是否有含有编码类丙酮酸脱羧酶系相关基因 | 第26-27页 |
| 2.3.4 酿酒酵母菌株S_1对抗生素G418、Zeocin的抗性实验 | 第27页 |
| 2.3.5 质粒的提取 | 第27-28页 |
| 2.3.6 敲除组件引物与验证引物的设计 | 第28页 |
| 2.3.7 敲除组件Y1-Y2构建 | 第28-29页 |
| 2.3.8 敲除组件的纯化 | 第29页 |
| 2.3.9 酵母电转化法转化纯化后的敲除组件至酿酒酵母 | 第29-30页 |
| 2.3.10 阳性菌落的筛选与鉴定 | 第30页 |
| 2.3.11 麦芽汁的制备 | 第30-31页 |
| 2.3.12 改造菌与初始菌S_1的发酵实验 | 第31页 |
| 2.3.13 气相色谱法测定异戊醇含量 | 第31-32页 |
| 2.3.14 酵母电转法转化质粒pSH65至阳性菌落并切除Kanr抗性标记基因 | 第32页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第32-42页 |
| 2.4.1 引物设计结果 | 第32-33页 |
| 2.4.2 酿酒酵母中编码类丙酮酸脱羧酶系关键基因THI3的验证结果 | 第33页 |
| 2.4.3 酿酒酵母S1对抗生素G418、Zeocin的抗性实验结果 | 第33-35页 |
| 2.4.4 构建THI3基因敲除组件的PCR最佳退火温度确定验结果 | 第35-36页 |
| 2.4.5 阳性菌落的筛选验证结果 | 第36页 |
| 2.4.6 阳性菌株的发酵实验 | 第36-40页 |
| 2.4.7 工程菌株1的传代稳定性 | 第40-41页 |
| 2.4.8 影印平板发筛选出切除抗性标记的菌株 | 第41页 |
| 2.4.9 去除质粒pSH65的工程酵母菌株 | 第41-42页 |
| 2.5 本章小结 | 第42-43页 |
| 第三章 LEU2基因缺失酵母菌的构建 | 第43-54页 |
| 3.1 引言 | 第43页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第43-45页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第43页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第43-44页 |
| 3.2.3 主要仪器设备 | 第44页 |
| 3.2.4 主要溶液的配置 | 第44-45页 |
| 3.2.5 主要培养基的配置 | 第45页 |
| 3.3 实验方法 | 第45-48页 |
| 3.3.1 敲除组件引物和验证引物的构建方法 | 第45页 |
| 3.3.2 验证菌株S_2中是否含有编码 β－异丙基苹果酸脱氢酶的关键基因 | 第45-46页 |
| 3.3.3 构建LEU2基因的敲除组件的PCR温度梯度试验 | 第46页 |
| 3.3.4 酵母电转化法将敲除组件成功转入酿酒酵母S_2中 | 第46页 |
| 3.3.5 阳性菌落的鉴定和筛选 | 第46-47页 |
| 3.3.6 工程菌株的发酵实验 | 第47页 |
| 3.3.7 气相色谱法测定异戊醇含量 | 第47-48页 |
| 3.3.8 传代获得丢失质粒pSH65并且获得LEU2基因缺失的酵母菌株 | 第48页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第48-53页 |
| 3.4.1 引物设计结果 | 第48页 |
| 3.4.2 编码 β－异丙基苹果酸脱氢酶的关键基因LEU2验证结果 | 第48-49页 |
| 3.4.3 LEU2基因敲除组件的构建的PCR温度梯度实验结果 | 第49-50页 |
| 3.4.4 将敲除组件转入酵母菌株并进行阳性菌落的筛选和鉴定 | 第50页 |
| 3.4.5 工程菌株与酵母菌株S_2的发酵实验 | 第50-51页 |
| 3.4.6 影印平板法筛选出切除抗性标记的菌株 | 第51-52页 |
| 3.4.7 传代获得丢失质粒pSH65并且LEU2基因缺失的酵母菌株 | 第52-53页 |
| 3.5 本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 工程菌株S_2的液态和半固态发酵应用研究 | 第54-67页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 实验材料 | 第54-55页 |
| 4.2.1 菌种 | 第54页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第54页 |
| 4.2.3 主要溶液 | 第54-55页 |
| 4.2.4 主要仪器及设备 | 第55页 |
| 4.3 实验方法 | 第55-58页 |
| 4.3.1 影响工程菌株S_2液态发酵产异戊醇及高级醇的单因素探究 | 第55-57页 |
| 4.3.2 影响工程菌株S_2半固态发酵产异戊醇的因素探究 | 第57-58页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第58-65页 |
| 4.4.1 工程菌株S_2液态发酵产异戊醇及高级醇的单因素探究结果分析 | 第58-64页 |
| 4.4.2 工程菌株S_2半固态发酵产异戊醇及高级醇探究结果分析 | 第64-65页 |
| 4.5 本章小结 | 第65-67页 |
| 结论与展望 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-73页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 附表 | 第75页 |
