| 致谢 | 第4-5页 |
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第一章 绪论 | 第12-23页 |
| 1.1 引言 | 第12页 |
| 1.2 ALA在农业和医药领域的应用 | 第12-16页 |
| 1.2.1 ALA在农业领域的应用 | 第13-14页 |
| 1.2.2 ALA在医药领域的应用 | 第14-16页 |
| 1.3 5-氨基乙酰丙酸的合成方法 | 第16-19页 |
| 1.3.1 ALA的化学合成法 | 第16-17页 |
| 1.3.2 ALA的生物合成法 | 第17-19页 |
| 1.4 发酵液中溶解氧对菌体代谢的影响 | 第19-20页 |
| 1.5 大肠杆菌密码子偏爱性及基因全合成 | 第20-21页 |
| 1.6 同源重组技术 | 第21-22页 |
| 1.7 本工作的研究思路及拟研究内容 | 第22-23页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第23-37页 |
| 2.1 菌种与质粒 | 第23页 |
| 2.2 仪器与试剂 | 第23-24页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.2 工具酶及主要试剂 | 第24页 |
| 2.3 培养基与培养条件 | 第24-25页 |
| 2.3.1 培养基与前体 | 第24-25页 |
| 2.4 检测与分析方法 | 第25-37页 |
| 2.4.1 分子克隆相关实验 | 第25页 |
| 2.4.2 pH的测定 | 第25页 |
| 2.4.3 细胞密度的测定 | 第25页 |
| 2.4.4 葡萄糖浓度的测定 | 第25页 |
| 2.4.5 蛋白浓度的测定 | 第25页 |
| 2.4.6 大肠杆菌细胞超生破碎及胞内蛋白的提取 | 第25-26页 |
| 2.4.7 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第26页 |
| 2.4.8 ALA合成酶活力的测定 | 第26-27页 |
| 2.4.9 5-氨基乙酰丙酸(ALA)的测定 | 第27-32页 |
| 2.4.10 甘氨酸的测定 | 第32-33页 |
| 2.4.11 琥珀酸的测定 | 第33-35页 |
| 2.4.12 乙酸的测定 | 第35-37页 |
| 第三章 野生型大肠杆菌MG1655作为宿主发酵产ALA的研究 | 第37-55页 |
| 3.1 引言 | 第37-38页 |
| 3.2 材料与方法 | 第38-39页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第38页 |
| 3.2.2 质粒DNA的提取与转化 | 第38页 |
| 3.2.3 工程菌的构建 | 第38页 |
| 3.2.4 培养基及前体 | 第38页 |
| 3.2.5 工程菌的培养条件 | 第38-39页 |
| 3.2.6 检测方法 | 第39页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第39-54页 |
| 3.3.1 重组菌外源基因诱导表达条件的优化 | 第39-41页 |
| 3.3.2 工程菌利用不同氮源对菌体生长及ALA合成的影响 | 第41-44页 |
| 3.3.3 以尿素为氮源时不同装液量对重组菌产ALA的影响 | 第44-45页 |
| 3.3.4 利用不同碳源对重组菌合成ALA的影响 | 第45-47页 |
| 3.3.5 不同初始甘油浓度下重组菌合成ALA的情况 | 第47-49页 |
| 3.3.6 重组菌以甘油为碳源的发酵罐放大实验 | 第49-50页 |
| 3.3.7 5-氨基乙酰丙酸合成酶基因优化菌株的构建 | 第50-51页 |
| 3.3.8 ALA合成酶基因优化菌与未优化菌的摇瓶对比实验 | 第51-53页 |
| 3.3.9 5-氨基乙酰丙酸合成酶基因优化菌的发酵罐放大实验 | 第53-54页 |
| 3.4 小结 | 第54-55页 |
| 第四章 短暂厌氧发酵对重组大肠杆菌产ALA的影响 | 第55-70页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 材料与方法 | 第55-57页 |
| 4.2.1 菌种 | 第55-56页 |
| 4.2.2 培养基及前体 | 第56页 |
| 4.2.3 工程菌的培养条件 | 第56-57页 |
| 4.2.4 检测方法 | 第57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-67页 |
| 4.3.1 好氧发酵与短暂厌氧发酵的发酵结果对比 | 第57-59页 |
| 4.3.2 不同厌氧发酵时间对重组菌的生长和产ALA的影响 | 第59-61页 |
| 4.3.3 不同厌氧发酵时间对重组蛋白表达及酶活的影响 | 第61-64页 |
| 4.3.4 采用短暂厌氧操作进行发酵罐放大实验 | 第64-66页 |
| 4.3.5 前体与葡萄糖混合流加操作策略合成ALA的发酵罐放大实验 | 第66-67页 |
| 4.4 小结 | 第67-70页 |
| 第五章 基因整合优化大肠杆菌产ALA的初步研究 | 第70-82页 |
| 5.1 引言 | 第70-71页 |
| 5.2 材料与方法 | 第71-76页 |
| 5.2.1 菌种与质粒 | 第71-72页 |
| 5.2.2 基本培养条件 | 第72页 |
| 5.2.3 工具酶及主要试剂 | 第72页 |
| 5.2.4 质粒的提取与转化 | 第72页 |
| 5.2.5 MG1655基因组的提取 | 第72-73页 |
| 5.2.6 利用PCR引物设计在hemB基因引入点突变 | 第73页 |
| 5.2.7 氯霉素抗性基因的PCR扩增 | 第73-74页 |
| 5.2.8 重组模板质粒的构建 | 第74页 |
| 5.2.9 融合PCR构建ALA合成酶基因同源重组片段 | 第74-76页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第76-81页 |
| 5.3.1 基因hemB’的PCR扩增及pMD-19T-hemB’单酶切鉴定 | 第76-77页 |
| 5.3.2 氯霉素抗性基因的PCR扩增及pMD-19T-Cm的酶切鉴定 | 第77-78页 |
| 5.3.3 hemB’基因Red同源重组片段的获得 | 第78-79页 |
| 5.3.4 hemA基因Red同源重组片段的获得 | 第79-81页 |
| 5.4 小结 | 第81-82页 |
| 第六章 结论与展望 | 第82-84页 |
| 6.1 结论 | 第82-83页 |
| 6.2 展望 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-92页 |
| 附录 | 第92页 |
