| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语表（Abbreviation） | 第11-12页 |
| 1. 前言 | 第12-31页 |
| 1.1 引言（问题的由来） | 第12-13页 |
| 1.2 文献综述 | 第13-30页 |
| 1.2.1 布鲁氏菌 | 第13-16页 |
| 1.2.1.1 布鲁氏菌的生物学特性 | 第13-14页 |
| 1.2.1.2 布鲁氏菌的致病机制 | 第14-15页 |
| 1.2.1.3 布鲁氏菌病临床症状 | 第15页 |
| 1.2.1.4 布鲁氏菌疫苗研究进展 | 第15-16页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统 | 第16-27页 |
| 1.2.2.1CRISPR/Cas系统的研究历史 | 第16页 |
| 1.2.2.2 CRISPR/Cas的结构 | 第16-17页 |
| 1.2.2.3 CRISPR/Cas的分类 | 第17-19页 |
| 1.2.2.4 CRISPR/Cas的工作机制 | 第19-23页 |
| 1.2.2.5 CRISPR/Cas9系统和它的应用 | 第23-24页 |
| 1.2.2.6 CRISPRi系统 | 第24-27页 |
| 1.2.3 乳糖操纵子诱导系统 | 第27-28页 |
| 1.2.4 原核生物的NHEJ修复途径 | 第28-30页 |
| 1.2.5 MS2噬菌体衣壳蛋白和它的应用 | 第30页 |
| 1.3 研究目的与意义 | 第30-31页 |
| 2. 材料与方法 | 第31-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-43页 |
| 2.1.1 菌株 | 第31-32页 |
| 2.1.2 质粒 | 第32-34页 |
| 2.1.3 引物 | 第34-37页 |
| 2.1.4 主要试剂，耗材 | 第37-38页 |
| 2.1.5 主要培养基的配制 | 第38-39页 |
| 2.1.6 主要溶液的配制 | 第39-43页 |
| 2.2 实验方法 | 第43-56页 |
| 2.2.1 DNA相关常规操作 | 第43-51页 |
| 2.2.1.1 大肠杆菌质粒提取 | 第43-44页 |
| 2.2.1.2 PCR方法 | 第44页 |
| 2.2.1.3 qPCR方法 | 第44-45页 |
| 2.2.1.4 DNA酶切方法 | 第45页 |
| 2.2.1.5 引物磷酸化 | 第45页 |
| 2.2.1.6 sgRNA的设计和形成方法 | 第45-46页 |
| 2.2.1.7 DNA纯化方法 | 第46-47页 |
| 2.2.1.8 同源重组反应 | 第47页 |
| 2.2.1.9 连接反应 | 第47-48页 |
| 2.2.1.10 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第48页 |
| 2.2.1.11 DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 | 第48页 |
| 2.2.1.12 大肠杆菌化学转化 | 第48-49页 |
| 2.2.1.13 布鲁氏菌电转化 | 第49页 |
| 2.2.1.14 布鲁氏菌基因组提取 | 第49-50页 |
| 2.2.1.15 T7E1分析突变 | 第50-51页 |
| 2.2.2 RNA相关操作 | 第51-52页 |
| 2.2.2.1 布鲁氏菌总RNA提取 | 第51-52页 |
| 2.2.2.2 反转录方法 | 第52页 |
| 2.2.3 western blot | 第52-54页 |
| 2.2.4 感受态的制备 | 第54-55页 |
| 2.2.4.1 大肠杆菌化学感受态的制备 | 第54页 |
| 2.2.4.2 布鲁氏菌电转感受态的制备 | 第54-55页 |
| 2.2.5 布鲁氏菌的灭活与收集 | 第55-56页 |
| 3. 结果与分析 | 第56-87页 |
| 3.1 CRISPRi系统在布鲁氏菌中的应用研究 | 第56-70页 |
| 3.1.1 CRISPRi工作质粒的构建和功能验证 | 第56-61页 |
| 3.1.1.1 CRISPRi工作质粒的构建 | 第56-60页 |
| 3.1.1.2 CRISPRi在布鲁氏菌中的功能检测 | 第60-61页 |
| 3.1.2 布鲁氏菌中CRISPRi系统的优化研究 | 第61-65页 |
| 3.1.2.1 探索比较布鲁氏菌中组成型表达与诱导型表达模式的表达量 | 第62-63页 |
| 3.1.2.2 探究最优的启动子组合 | 第63-65页 |
| 3.1.3 对优化的CRISPRi工作质粒的构建和验证 | 第65-70页 |
| 3.1.3.1 优化的CRISPRi工作质粒的构建 | 第66-68页 |
| 3.1.3.2 优化的CRISPRi工作质粒在布鲁氏菌中的功能检测 | 第68-70页 |
| 3.2 CRISPR/Cas9系统在布鲁氏菌中的应用研究 | 第70-87页 |
| 3.2.1 CRISPR/Cas9工作质粒的构建和功能验证 | 第70-76页 |
| 3.2.1.1 CRISPR/Cas9工作质粒的构建 | 第70-74页 |
| 3.2.1.2 CRISPR/Cas9在布鲁氏菌中的功能检测 | 第74-76页 |
| 3.2.2 布鲁氏菌中NHEJ修复系统的建立 | 第76-81页 |
| 3.2.2.1 NHEJ质粒的构建 | 第76-79页 |
| 3.2.2.2 验证构建的NHEJ系统的功能 | 第79-81页 |
| 3.2.3 布鲁氏菌中NHEJ修复系统的优化 | 第81-87页 |
| 3.2.3.1 NHEJ修复途径的优化与工作质粒的构建 | 第82-84页 |
| 3.2.3.2 sgRNA的优化与CRISPR/Cas9工作质粒的构建 | 第84-86页 |
| 3.2.3.3 优化后NHEJ系统的功能验证 | 第86-87页 |
| 4. 讨论与结论 | 第87-91页 |
| 4.1 关于CRISPRi系统对布鲁氏菌基因下调的效率 | 第87-88页 |
| 4.2 关于CRISPR/Cas9系统在布鲁氏菌中的研究 | 第88-89页 |
| 4.3 结论 | 第89-91页 |
| 参考文献 | 第91-97页 |
| 致谢 | 第97页 |
