| ABSTRACT | 第10页 |
| 摘要 | 第11-12页 |
| LIST OF ABBREVATIONS | 第12-15页 |
| 1 BACKGROUND | 第15-16页 |
| 2 INTRODUCTION | 第16-37页 |
| 2.1 Role of K~+ in bacterial survival | 第16页 |
| 2.2 K~+ uptake systems in bacteria | 第16-18页 |
| 2.2.1 Constitutively expressed K~+ uptake system | 第16-17页 |
| 2.2.2 Inducible K~+ uptake system | 第17-18页 |
| 2.3 Distribution of Kdp-ATPase system in bacteria | 第18页 |
| 2.4 Organization of kdpFABC and kdpDE operons | 第18-19页 |
| 2.5 KdpD/KdpE as two-component system | 第19-20页 |
| 2.6 Kdp-ATPase expression control by Kdp D/KdpE TCS | 第20页 |
| 2.7 Structure and function of KdpD | 第20-21页 |
| 2.8 Structure and function of KdpE | 第21-22页 |
| 2.9 Proposed Stimuli for KdpD activation | 第22页 |
| 2.10 Turgor pressure not induced kdp expression | 第22-24页 |
| 2.11 Signaling model of KdpD/KdpE TCS | 第24-25页 |
| 2.12 Role of KdpD/KdpE TCS in bacterial virulence | 第25-28页 |
| 2.13 KdpD/KdpE TCS in different bacterial species | 第28-34页 |
| 2.13.1 Escherichia coli | 第28-30页 |
| 2.13.2 Staphylococcus aureus | 第30-32页 |
| 2.13.3 Mycobacterium tuberculosis | 第32页 |
| 2.13.4 Clostridium acetobutylicum | 第32-34页 |
| 2.13.5 Salmonella typhimurium | 第34页 |
| 2.13.6 Acinetobacter baumannii | 第34页 |
| 2.14 Genus Mycobacterium | 第34-35页 |
| 2.15 Mycobacterium smegmatis | 第35-36页 |
| RESEARCH OBJECTIVES AND SIGNIFICANCE | 第36-37页 |
| 3 MATERIALS AND METHODS | 第37-54页 |
| 3.1 Bacterial strains and growth conditions | 第37-40页 |
| 3.1.1 M. smegmatis | 第37页 |
| 3.1.2 E.coli | 第37-40页 |
| 3.2 Molecular biology techniques | 第40-45页 |
| 3.2.1 Polymerase chain reaction (PCR) | 第40-41页 |
| 3.2.2 Agarose gel electrophoresis | 第41页 |
| 3.2.3 Purification of DNA | 第41页 |
| 3.2.4 Plasmid extraction | 第41页 |
| 3.2.5 DNA digestion with restriction endonucleases | 第41-42页 |
| 3.2.6 DNA ligation | 第42页 |
| 3.2.7 Preparation of chemically competent cells of E. coli | 第42页 |
| 3.2.8 Plasmid DNA transformation in E. coli competent cells | 第42-43页 |
| 3.2.9 Sequencing of DNA fragments | 第43页 |
| 3.2.10 Expression, identification and purification of KdpE protein | 第43-44页 |
| 3.2.11 Electro-mobility shift assay (EMSA) | 第44页 |
| 3.2.12 DNase-I foot printing | 第44-45页 |
| 3.3 Mycobacterial Special Techniques | 第45-54页 |
| 3.3.1 M. smegmatis genomic DNA isolation | 第45页 |
| 3.3.2 M. smegmatis competent cells | 第45页 |
| 3.3.3 Electroporation of plasmid DNA | 第45-46页 |
| 3.3.4 Construction of mutants | 第46页 |
| 3.3.5 Complementation of ?kdpE | 第46页 |
| 3.3.6 RNA extraction from M. smegmatis | 第46-47页 |
| 3.3.7 cDNA synthesis | 第47页 |
| 3.3.8 Reverse transcriptase (RT-PCR) and real time quantitative PCR (RT-qPCR) | 第47-48页 |
| 3.3.9 5′-Rapid Amplification of cDNA Ends (5′-RACE) | 第48-49页 |
| 3.3.10 Promoter functionality β-galactosidase assay | 第49页 |
| 3.3.11 β-galactosidase assay for kdpF confirmation and functionality of kdpFABC operonunder different conditions | 第49-50页 |
| 3.3.12 Stress conditions | 第50-54页 |
| 4 RESULTS | 第54-84页 |
| 4.1 kdpD gene deletion | 第54-56页 |
| 4.2 kdpE gene deletion | 第56-58页 |
| 4.3 △kdpE complementary strain | 第58-59页 |
| 4.4 Expression of kdpFABC operon under K~+ limiting condition and its regulation by theKdpD/KdpE TCS | 第59-60页 |
| 4.5 Co-transcription of kdpFABC and kdpDE operons under low K~+ condition | 第60-61页 |
| 4.6 Heterologous expression of KdpE | 第61页 |
| 4.7 Binding of KdpE protein to PkdpF | 第61-62页 |
| 4.8 No binding of KdpE to PkdpD | 第62页 |
| 4.9 Promoter functionality β-galactosidase assay for P5391 and PkdpD | 第62-63页 |
| 4.10 KdpE foot print in the PkdpF | 第63-64页 |
| 4.11 Minimum KdpE binding motif in the PkdpF | 第64-66页 |
| 4.12 KdpE binding motif in different bacterial species | 第66页 |
| 4.13 KdpE binding motif in genus Mycobacterium | 第66-67页 |
| 4.14 TSS of the kdp FABC operon | 第67-70页 |
| 4.15 Effects of the salts on the expression of kdpFABC | 第70-75页 |
| 4.15.1 Effects of low K~+ on kdpFABC expression | 第71-73页 |
| 4.15.2 Effects of osmotic upshift on kdpFABC expression | 第73页 |
| 4.15.3 Effects of medium pH on kdpFABC expression | 第73-75页 |
| 4.16 kdp genes expression under osmotic upshift | 第75页 |
| 4.17 Requirement of Kdp E for the normal growth of M. smegmatis | 第75-78页 |
| 4.18 Trk system and other K~+ channels genes expression under K~+ limiting condition | 第78-79页 |
| 4.19 Proposed model of KdpFABC transcriptional regulation by KdpD/KdpE TCS | 第79-80页 |
| 4.20 Organization of kdpFABC and kdpDE operons in mycobacterial species | 第80-84页 |
| 5 DISCUSSION | 第84-89页 |
| 6 CONCLUSION, NOVELITY AND FUTURE PROSPECTIVES | 第89-90页 |
| REFERENCES | 第90-102页 |
| LIST OF PUBLICATIONS | 第102-103页 |
| ACKNOWLEDGEMENT | 第103-105页 |
