| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-24页 |
| 1.1 水产养殖业病害发生及疫苗 | 第13-14页 |
| 1.2 糖酵解途径的持家酶 | 第14-17页 |
| 1.2.1 1,6-二磷酸果糖醛缩酶 | 第14-15页 |
| 1.2.2 其他糖酵解持家酶 | 第15页 |
| 1.2.3 持家酶的分泌 | 第15-17页 |
| 1.3 杀鱼爱德华氏菌及致病机制 | 第17页 |
| 1.4 革兰氏阴性菌的分泌系统 | 第17-23页 |
| 1.4.1 两步分泌途径 | 第18-21页 |
| 1.4.2 一步分泌途径 | 第21-22页 |
| 1.4.3 其他分泌系统 | 第22-23页 |
| 1.5 本研究主要内容和意义 | 第23-24页 |
| 第2章 FBA作为广谱型亚单位疫苗的免疫原性 | 第24-47页 |
| 2.1 前言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-26页 |
| 2.2.1 实验试剂与材料 | 第24页 |
| 2.2.2 菌株、质粒载体与引物 | 第24页 |
| 2.2.3 细菌及实验动物斑马鱼与大菱鲆 | 第24-26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-33页 |
| 2.3.1 五种海洋病原菌fba基因的克隆、表达和蛋白纯化 | 第27-28页 |
| 2.3.2 FBA蛋白的鉴定 | 第28-30页 |
| 2.3.3 多克隆抗体的制备 | 第30页 |
| 2.3.4 五种海洋病原菌胞外蛋白、周质空间蛋白及外膜蛋白的提取 | 第30-31页 |
| 2.3.5 对斑马鱼的免疫与攻毒 | 第31-32页 |
| 2.3.6 对大菱鲆的免疫与攻毒 | 第32页 |
| 2.3.7 免疫后大菱鲆血清针对免疫原FBA蛋白的特异性分析 | 第32页 |
| 2.3.8 免疫后大菱鲆血清针对五种病原菌的特异性分析 | 第32-33页 |
| 2.3.9 血清杀菌活力测定 | 第33页 |
| 2.3.10 斑马鱼脾脏及肾脏组织RNA提取及逆转录 | 第33页 |
| 2.3.11 免疫因子表达水平的分析 | 第33页 |
| 2.4 实验结果 | 第33-45页 |
| 2.4.1 FBA在不同病原菌的序列对比分析 | 第33-34页 |
| 2.4.2 多克隆抗体的特异性及灵敏度 | 第34-36页 |
| 2.4.3 五种海洋病原菌FBA的非胞内定位 | 第36-37页 |
| 2.4.4 FBA的免疫保护效力 | 第37-38页 |
| 2.4.5 FBA免疫大菱鲆后的体液免疫效果 | 第38-41页 |
| 2.4.6 经FBA免疫后免疫相关基因的转录水平差异 | 第41-45页 |
| 2.5 讨论 | 第45页 |
| 2.6 本章小结 | 第45-47页 |
| 第3章 杀鱼爱德华氏菌FBA的分泌途径 | 第47-66页 |
| 3.1 前言 | 第47页 |
| 3.2 实验材料 | 第47页 |
| 3.3 实验方法 | 第47-54页 |
| 3.3.1 胞外蛋白的提取 | 第47-49页 |
| 3.3.2 外膜小泡的样品制备 | 第49页 |
| 3.3.3 Sec途径缺失株的构建 | 第49-51页 |
| 3.3.4 带有His标签的FBA表达菌株构建和验证 | 第51-53页 |
| 3.3.5 SecB与FBA相互作用的测定 | 第53页 |
| 3.3.6 胞外蛋白的检测 | 第53-54页 |
| 3.4 实验结果 | 第54-64页 |
| 3.4.1 经典分泌途径与FBA分泌相关性 | 第54-57页 |
| 3.4.2 FBA分泌相关蛋白 | 第57-60页 |
| 3.4.3 FBA分泌相关基因 | 第60-64页 |
| 3.5 讨论 | 第64-65页 |
| 3.6 本章小结 | 第65-66页 |
| 第4章 杀鱼爱德华氏菌FBA的分泌调控 | 第66-91页 |
| 4.1 前言 | 第66页 |
| 4.2 实验材料 | 第66页 |
| 4.3 实验方法 | 第66-71页 |
| 4.3.1 FBA分泌水平分析 | 第66-68页 |
| 4.3.2 构建用于分析FBA潜在信号肽的菌株 | 第68-69页 |
| 4.3.3 RNA的抽提和逆转录及RT-qPCR | 第69页 |
| 4.3.4 内参基因分析软件BestKeeper、GeNorm和Normfinder | 第69页 |
| 4.3.5 Chip-seq实验 | 第69-71页 |
| 4.4 实验结果 | 第71-88页 |
| 4.4.1 FBA在不同条件下的分泌水平 | 第71-74页 |
| 4.4.2 FBA的分泌不需要信号肽 | 第74页 |
| 4.4.3 缺失株EIB202/△esrA和EIB202/△esrC的FBA分泌水平 | 第74-76页 |
| 4.4.4 esrC调控的下游基因 | 第76页 |
| 4.4.5 菌体生长不同阶段fba基因的转录水平 | 第76-88页 |
| 4.5 讨论 | 第88-90页 |
| 4.6 本章小结 | 第90-91页 |
| 第5章 杀鱼爱德华氏菌胞外FBA的功能 | 第91-100页 |
| 5.1 前言 | 第91页 |
| 5.2 实验材料 | 第91页 |
| 5.3 实验方法 | 第91-94页 |
| 5.3.1 FBA酶活分析 | 第91-92页 |
| 5.3.2 非变性Western-blot | 第92页 |
| 5.3.3 毒力不同的E.piscicida菌株FBA分泌量相对定量分析 | 第92-93页 |
| 5.3.4 细胞侵染 | 第93-94页 |
| 5.4 实验结果 | 第94-98页 |
| 5.4.1 非胞内FBA酶活 | 第94-96页 |
| 5.4.2 分泌到胞外的FBA的结构 | 第96页 |
| 5.4.3 FBA分泌量与病原菌毒力相关性 | 第96-97页 |
| 5.4.4 FBA在病原菌侵染细胞过程中的黏附作用 | 第97-98页 |
| 5.5 讨论 | 第98-99页 |
| 5.6 本章小结 | 第99-100页 |
| 第6章 结论和创新点 | 第100-102页 |
| 6.1 主要结论 | 第100-101页 |
| 6.2 论文创新点 | 第101页 |
| 6.3 展望 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-112页 |
| 攻读博士学位期间研究成果 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 附录1 E.piscicida EIB202/△P插入失活突变株文库 | 第114-135页 |
| 附录2 突变体文库筛选FBA分泌相关基因的ELISA结果 | 第135-164页 |
