| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 英文缩略表 | 第7-11页 |
| 第一部分 文章综述 | 第11-30页 |
| 1. 有机磷农药的简介 | 第11页 |
| 2. 有机磷降解酶的简介 | 第11-14页 |
| ·目前已发表的有机磷降解酶基因 | 第11-13页 |
| ·有机磷降解酶的作用机制 | 第13-14页 |
| ·有机磷降解酶的分类 | 第14页 |
| 3. 有机磷降解酶分子与其酶活性的研究进展 | 第14-17页 |
| ·乙基对硫磷水解酶和甲基对硫磷水解酶的性质比较 | 第14页 |
| ·乙基对硫磷水解酶和甲基对硫磷水解酶的结构比较 | 第14-16页 |
| ·乙基对硫磷水解酶（Parathion hydrolase, PH）的研究现状 | 第14-15页 |
| ·甲基对硫磷水解酶（Methylparhationhydrolase, MPH）的研究现状 | 第15-16页 |
| ·甲基对硫磷水解酶MPH 和OPHC2 的比较 | 第16-17页 |
| 4. 热稳定性研究进展 | 第17-25页 |
| ·嗜热酶的研究意义 | 第17-18页 |
| ·嗜热酶的生化特性 | 第18页 |
| ·热稳定性的机制 | 第18-24页 |
| ·嗜热酶的结构特征 | 第18页 |
| ·嗜热酶的热稳定性机制 | 第18-24页 |
| ·嗜热酶的工业应用 | 第24-25页 |
| 5. 提高热稳定性的策略 | 第25-28页 |
| ·蛋白质工程策略提高热稳定性 | 第25-27页 |
| ·定点突变技术 | 第25-26页 |
| ·定向进化技术 | 第26-27页 |
| ·其他提高蛋白热稳定性的方法 | 第27-28页 |
| ·化学修饰 | 第27-28页 |
| ·添加稳定剂 | 第28页 |
| 6. 问题与展望 | 第28页 |
| 7. 研究的目的与意义 | 第28-29页 |
| 8. 本实验技术路线图 | 第29-30页 |
| 第二部分 实验材料与方法 | 第30-46页 |
| 1. 实验材料与仪器 | 第30-32页 |
| ·菌株与质粒 | 第30页 |
| ·工具酶与试剂 | 第30页 |
| ·溶液的配制 | 第30-31页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳溶液的配制 | 第30页 |
| ·蛋白纯化溶液的配制 | 第30-31页 |
| ·其他 | 第31页 |
| ·培养基 | 第31页 |
| ·培养条件 | 第31页 |
| ·实验仪器 | 第31-32页 |
| 2. 试验方法 | 第32-46页 |
| ·甲基对硫磷水解酶基因mph 的定点突变 | 第32-36页 |
| ·甲基对硫磷水解酶MPH 质粒的获得 | 第32页 |
| ·质粒的PCR 验证 | 第32-33页 |
| ·MPH 突变位点的分析确定 | 第33页 |
| ·引物设计 | 第33页 |
| ·重叠PCR | 第33-36页 |
| ·甲基对硫磷水解酶MPH 以及其突变体的大肠杆菌重组表达质粒的构建 | 第36-42页 |
| ·从琼脂糖凝胶电泳中回收DNA 片段 | 第36-37页 |
| ·表达载体质粒的大量提取 | 第37-38页 |
| ·目的基因和表达载体的酶切回收 | 第38-39页 |
| ·目的片段与载体连接 | 第39页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第39-40页 |
| ·连接产物的转化 | 第40页 |
| ·重组子的筛选鉴定 | 第40-41页 |
| ·甲基对硫磷水解酶MPH 及其突变体的基因测序分析 | 第41-42页 |
| ·甲基对硫磷水解酶MPH 以及其突变体在大肠杆菌中的诱导表达及检测 | 第42页 |
| ·甲基对硫磷水解酶MPH 以及突变体基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第42页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测 | 第42页 |
| ·酶活性检测 | 第42页 |
| ·野生型MPH 及其突变体的蛋白纯化和检测 | 第42-44页 |
| ·野生型MPH 及其突变体的蛋白纯化 | 第42-43页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测 | 第43-44页 |
| ·甲基对硫磷水解酶活性检测方法 | 第44页 |
| ·野生型MPH 及其突变体的酶学性质检测 | 第44-45页 |
| ·比活性的测定 | 第44页 |
| ·野生型MPH 及其突变体的热稳定性 | 第44页 |
| ·野生型MPH 及其突变体的半衰期测定 | 第44-45页 |
| ·野生型MPH 同源建模分析 | 第45页 |
| ·Potential energy 的计算 | 第45-46页 |
| 第三部分 实验结果与分析 | 第46-57页 |
| 1.M PH 的比对结果及突变位点的确定 | 第46-47页 |
| 2. 甲基对硫磷水解酶MPH 基因的克隆及原核表达载体的构建 | 第47-49页 |
| ·甲基对硫磷水解酶MPH 基因的扩增 | 第47页 |
| ·mph 基因扩增片段和表达载体的酶切回收 | 第47-48页 |
| ·表达重组载体pET30-mph 的构建 | 第48-49页 |
| ·原核表达载体的酶切验证 | 第49页 |
| 3.M PH 突变体的克隆及原核表达载体的构建 | 第49-52页 |
| ·突变基因的获得 | 第49-51页 |
| ·重组表达质粒pET-MPH10 、pET-MPHP41D_P43K 、pET-MPHP41D 和pET-MPHP43K 的构建 | 第51-52页 |
| 4. 甲基对硫磷水解酶MPH 和突变体在大肠杆菌中的表达 | 第52页 |
| 5. 甲基对硫磷水解酶MPH 和突变酶的纯化 | 第52-54页 |
| 6. 甲基对硫磷水解酶MPH 和突变体酶学性质检测 | 第54-56页 |
| ·比活性的测定 | 第54页 |
| ·原酶以及突变酶热稳定性的比较 | 第54-55页 |
| ·原酶以及突变酶半衰期的比较 | 第55-56页 |
| 7. 甲基对硫磷水解酶MPH 的同源建模分析 | 第56页 |
| 8. 蛋白质Potential energy 的计算 | 第56-57页 |
| 第四部分 结果讨论与进一步工作设想 | 第57-60页 |
| 1. 结果讨论 | 第57-58页 |
| 2. 进一步工作设想 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 附录 | 第70页 |
