| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 第一章 前言 | 第12-30页 |
| 1.1 细胞程序性死亡简介 | 第12-21页 |
| 1.1.1 细胞凋亡与细胞坏死 | 第12-13页 |
| 1.1.2 细胞坏死机制 | 第13-20页 |
| 1.1.3 细胞坏死的生理学意义 | 第20-21页 |
| 1.2 丙酮酸脱氢酶复合体 | 第21-26页 |
| 1.2.1 丙酮酸脱氢酶复合体简介 | 第21-23页 |
| 1.2.2 丙酮酸脱氢酶复合体的活性调控 | 第23-25页 |
| 1.2.3 丙酮酸脱氢酶复合体活性调节的生理意义 | 第25-26页 |
| 1.3 靶向基因修饰技术 | 第26-29页 |
| 1.3.1 TALEN介导的靶向基因修饰技术 | 第26-28页 |
| 1.3.2 CRISPR介导的基因编辑技术 | 第28-29页 |
| 1.4 立题背景 | 第29-30页 |
| 第二章 材料与方法 | 第30-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第30页 |
| 2.2 实验仪器 | 第30-31页 |
| 2.3 分子克隆相关实验方法 | 第31-36页 |
| 2.3.1 质粒载体 | 第31-33页 |
| 2.3.2 DNA电泳及片段回收 | 第33页 |
| 2.3.3 DNA连接反应 | 第33页 |
| 2.3.4 质粒转化感受态细胞 | 第33-34页 |
| 2.3.5 中量提取质粒 | 第34页 |
| 2.3.6 基因组提取 | 第34-35页 |
| 2.3.7 RNA 提取 | 第35页 |
| 2.3.8 RNA的逆转录 | 第35页 |
| 2.3.9 实时荧光定量PCR | 第35-36页 |
| 2.4 细胞培养及相关实验 | 第36-38页 |
| 2.4.1 细胞培养基及相关溶液的配制 | 第36页 |
| 2.4.2 细胞培养 | 第36页 |
| 2.4.3 磷酸钙转染法 | 第36-37页 |
| 2.4.4 病毒感染 | 第37页 |
| 2.4.5 电转染 | 第37-38页 |
| 2.4.6 流式细胞术检测细胞存活率 | 第38页 |
| 2.5 蛋白纯化及蛋白质相关实验 | 第38-42页 |
| 2.5.1 原核细胞中融合蛋白的纯化 | 第38-39页 |
| 2.5.2 免疫共沉淀(Co- immunoprecipitation,co-IP) | 第39-40页 |
| 2.5.3 蛋白质免疫印迹(Western blot) | 第40-41页 |
| 2.5.4 γ-P~(32) -ATP放射性激酶反应实验 | 第41-42页 |
| 2.6 细胞代谢相关实验 | 第42-46页 |
| 2.6.1 Seahorse细胞能量代谢分析仪测定细胞酵解产酸速率和有氧呼吸速率 | 第42-43页 |
| 2.6.2 丙酮酸脱氢酶复合体活性测定 | 第43-44页 |
| 2.6.3 丙酮酸脱氢酶复合体体外激活实验及酶活性测定 | 第44-46页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第46-81页 |
| 3.1 细胞坏死和细胞凋亡过程中的细胞代谢情况存在差别 | 第46-52页 |
| 3.1.1 L929细胞坏死过程中糖酵解和有氧呼吸均被激活 | 第46-47页 |
| 3.1.2 坏死性刺激下L929细胞的有氧呼吸激活依赖于RIP3 | 第47页 |
| 3.1.3 小鼠胚胎成纤维细胞坏死过程中会发生依赖于RIP3的有氧呼吸激活 | 第47-48页 |
| 3.1.4 巨噬细胞系RAW264.7细胞坏死过程中会发生依赖于RIP3的有氧呼吸激活 | 第48-49页 |
| 3.1.5 人源HeLa细胞的坏死过程会发生有氧呼吸激活 | 第49-50页 |
| 3.1.6 坏死性刺激诱导的有氧呼吸激活依赖于RIP3的激酶活性 | 第50页 |
| 3.1.7 细胞凋亡过程不会发生有氧呼吸的激活 | 第50-52页 |
| 3.2 细胞有氧呼吸的激活参与细胞坏死 | 第52-62页 |
| 3.2.1 抑制酵解产酸过程不影响细胞坏死 | 第52-53页 |
| 3.2.2 抑制有氧呼吸过程可以抑制细胞坏死 | 第53-57页 |
| 3.2.3 促进有氧呼吸过程可以加速细胞坏死 | 第57-59页 |
| 3.2.4 去除L929细胞线粒体可抑制细胞坏死 | 第59-60页 |
| 3.2.5 抑制有氧呼吸不影响细胞凋亡 | 第60-61页 |
| 3.2.6 模型:糖代谢与细胞坏死的相关性 | 第61-62页 |
| 3.3 坏死性刺激下RIP3激活丙酮酸脱氢酶复合体 | 第62-68页 |
| 3.3.1 L929细胞坏死过程中会出现依赖于RIP3的PDC激活 | 第63-64页 |
| 3.3.2 细胞坏死过程中的PDC激活不是由于PDC-E1α的去磷酸化 | 第64-65页 |
| 3.3.3 体外实验中RIP3可直接激活PDC | 第65-66页 |
| 3.3.4 NIH3T3-A细胞凋亡时PDC不激活,而过表达RIP3的NIH3T3-A细胞坏死时发生PDC激活 | 第66-68页 |
| 3.3.5 人源细胞HeLa细胞的坏死过程会发生PDC激活 | 第68页 |
| 3.4 RIP3与丙酮酸脱氢酶复合体存在相互作用 | 第68-71页 |
| 3.4.1 坏死性刺激诱导RIP3与PDC相互作用 | 第69-70页 |
| 3.4.2 共转染实验中RIP3与PDC-E1α,PDC-E1 β,PDC-E3直接相互作用 | 第70-71页 |
| 3.5 RIP3直接磷酸化PDC-E3 | 第71-73页 |
| 3.5.1 RIP3磷酸化PDC-E3,不能磷酸化PDC-E1α,PDC-E1β,PDC-E2 | 第71-72页 |
| 3.5.2 PDC-E3被RIP3磷酸化的位点位于第86位-170位氨基酸片段上 | 第72-73页 |
| 3.6 MLKL参与RIP3对PDC的激活 | 第73-76页 |
| 3.6.1 MLKL KO L929细胞中坏死性刺激不能激活有氧呼吸 | 第73-74页 |
| 3.6.2 MLKL KO L929细胞中坏死性刺激不能激活PDC | 第74页 |
| 3.6.3 MLKL KO L929细胞中RIP3不能与PDC相互作用 | 第74-75页 |
| 3.6.4 MLKL参与RIP3的线粒体定位 | 第75-76页 |
| 3.7 坏死小体形成与PDC激活构成正反馈调节 | 第76-79页 |
| 3.7.1 抑制PDC活性影响坏死小体的形成 | 第76-78页 |
| 3.7.2 ROS清除剂BHA可抑制坏死小体的形成 | 第78-79页 |
| 3.7.3 模型: 坏死小体形成与PDC激活的正反馈调节 | 第79页 |
| 3.8 小结与讨论 | 第79-81页 |
| 附录1 图表索引 | 第81-84页 |
| 附录2 缩略语及中英文对照 | 第84-88页 |
| 参考文献 | 第88-95页 |
| 致谢 | 第95页 |
