| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 中英文缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-24页 |
| 1 真核生物的启动子 | 第15-16页 |
| 2 病毒启动子/增强子 | 第16-18页 |
| ·CMV启动子 | 第16-17页 |
| ·SV40启动子 | 第17页 |
| ·SV40增强子 | 第17-18页 |
| 3 脂联素(Adiponectin) | 第18-20页 |
| ·脂联素基因 | 第18-20页 |
| 4 启动子的研究进展 | 第20-24页 |
| 第二章 猪脂联素基因adiponectin特异调控元件确定 | 第24-51页 |
| 第一部分 adi-pro调控元件在细胞水平上的验证 | 第24-46页 |
| 1 前言 | 第24页 |
| 2 pGL3-adi-pro真核表达载体的构建 | 第24-34页 |
| ·试验材料与试剂 | 第24-28页 |
| ·猪组织提取DNA样品 | 第24-25页 |
| ·主要仪器和设备 | 第25页 |
| ·主要试剂 | 第25-26页 |
| ·主要溶液的配制 | 第26-27页 |
| ·载体和菌株 | 第27-28页 |
| ·主要生物学软件 | 第28页 |
| ·adi-pro片段的扩增 | 第28-31页 |
| ·猪基因组DNA的提取 | 第28-29页 |
| ·猪基因组DNA的浓度鉴定和质量检测 | 第29页 |
| ·猪脂联素adiponectin基因启动子部分序列引物的设计与合成 | 第29-30页 |
| ·PCR产物回收 | 第30页 |
| ·载体连接 | 第30页 |
| ·感受态细胞制备(CaCl_2法) | 第30-31页 |
| ·连接产物的转化 | 第31页 |
| ·阳性克隆的PCR鉴定和测序结果分析 | 第31页 |
| ·pGL3-adi-pro真核表达载体的构建 | 第31-34页 |
| ·限制性内切酶酶切位点的选取以及引物的设计 | 第31页 |
| ·带酶切位点片段PCR扩增与pMD-18T载体连接 | 第31页 |
| ·连接产物的转化与阳性克隆的挑取 | 第31-32页 |
| ·pMD-18T-adi-pro质粒小量提取 | 第32页 |
| ·pMD-18T-adi-pro质粒的双酶切反应 | 第32页 |
| ·pGL3-Basic真核表达载体酶切反应 | 第32-33页 |
| ·目的片段的回收 | 第33页 |
| ·连接反应 | 第33页 |
| ·连接产物的转化与阳性克隆PCR鉴定 | 第33页 |
| ·pGL3-adi-pro质粒的提取 | 第33-34页 |
| 3 细胞转染试验 | 第34-39页 |
| ·试验材料及试剂 | 第34-36页 |
| ·主要试剂 | 第34-35页 |
| ·试验主要仪器和设备 | 第35页 |
| ·主要试剂的配制 | 第35-36页 |
| ·3T3-L1小鼠前体脂肪细胞系以及C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系的培养 | 第36页 |
| ·细胞诱导分化的培养过程 | 第36-37页 |
| ·3T3-L1小鼠前体脂肪细胞系诱导分化为脂肪细胞的培养过程 | 第36-37页 |
| ·C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系诱导分化为肌管的培养过程 | 第37页 |
| ·瞬时转染试验 | 第37-38页 |
| ·双荧光素酶活性的测定 | 第38-39页 |
| 4 结果与分析 | 第39-46页 |
| ·猪脂联素基因adiponectin启动子部分序列adi-pro的扩增 | 第39页 |
| ·挑取阳性克隆测序结果 | 第39-40页 |
| ·构建pGL3-adi-pro载体的试验 | 第40-41页 |
| ·pGL3-Basic-adi-pro真核表达载体的构建方案 | 第40页 |
| ·双酶切pMD-18T-adi-pro质粒的结果 | 第40-41页 |
| ·双酶切pGL3-adi-pro质粒结果 | 第41页 |
| ·细胞转染试验 | 第41-43页 |
| ·3T3-L1小鼠前体脂肪细胞的形态学观察 | 第41-42页 |
| ·C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞的形态学观察 | 第42页 |
| ·诱导分化后的3T3-L1小鼠前体脂肪细胞 | 第42-43页 |
| ·诱导分化后的C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞 | 第43页 |
| ·双荧光素酶活性测定结果 | 第43-46页 |
| ·不同组织细胞之间的比较结果 | 第43-44页 |
| ·同一组织细胞不同时期的比较结果 | 第44-46页 |
| 第二部分 adi-pro调控元件与红色荧光蛋白融合基因的构建 | 第46-51页 |
| 1 前言 | 第46页 |
| 2 载体和菌株 | 第46-48页 |
| 3 试验步骤 | 第48页 |
| 4 结果与分析 | 第48-50页 |
| ·Red基因PCR扩增结果 | 第48页 |
| ·pGL3-adi-pro-Red质粒的酶切结果 | 第48-49页 |
| ·PCR扩增adi-pro-Red片段的结果 | 第49页 |
| ·Cla Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切质粒结果 | 第49-50页 |
| 5 下一步工作计划 | 第50-51页 |
| 第三章 组建含有不同启动子与增强子的调控元件 | 第51-72页 |
| 1 前言 | 第51页 |
| 2 试验用品 | 第51-53页 |
| ·试验材料与试剂 | 第51页 |
| ·试验所需载体 | 第51-53页 |
| 3 pGL3-Promoter-adi-pro,pGL3-Enhancer-adi-pro真核表达 | 第53-54页 |
| ·pMD-18T-adi-pro质粒的双酶切反应 | 第53页 |
| ·pGL3-Promoter与pGL3-Enhancer真核表达载体的酶切反应 | 第53页 |
| ·目的片段的回收 | 第53页 |
| ·连接反应 | 第53-54页 |
| ·pGL3-Promoter-adi-pro与pGL3-Enhancer-adi-pro质粒的提取 | 第54页 |
| 4 组建CMV-adi-pro嵌合启动子 | 第54-56页 |
| ·构建pGL3-CMV真核表达载体的试验 | 第54-55页 |
| ·CMV立即早期启动子(The immediate early promoter of cytomegalovirus)片段的获得 | 第54页 |
| ·PCR产物的回收 | 第54页 |
| ·与pMD-18T载体的连接,转化与检测 | 第54页 |
| ·pMD-18T-CMV质粒小量提取 | 第54页 |
| ·pGL3-Basic真核表达载体与pMD-18T-CMV载体的双酶切反应 | 第54-55页 |
| ·目的片段的回收 | 第55页 |
| ·连接反应 | 第55页 |
| ·连接产物的转化与阳性克隆PCR鉴定 | 第55页 |
| ·pGL3-CMV质粒的提取 | 第55页 |
| ·构建pGL3-CMV-adi-pro载体的试验 | 第55-56页 |
| ·带有Mlu Ⅰ与Xho Ⅰ酶切位点的adi-pro片段的获得 | 第55页 |
| ·pGL3-CMV载体与pMD-18T-adi-pro载体的双酶切反应 | 第55-56页 |
| ·目的片段的回收 | 第56页 |
| ·连接反应 | 第56页 |
| ·连接产物的转化与阳性克隆PCR鉴定 | 第56页 |
| ·pGL3-CMV-adi-pro质粒的提取 | 第56页 |
| 5 组建SVenh-adi-pro嵌合启动子 | 第56-57页 |
| ·SV40增强子片段的获得 | 第56页 |
| ·pGL3-SVenh-adi-pro载体的构建 | 第56-57页 |
| 6 细胞转染试验 | 第57-58页 |
| ·试验材料及试剂 | 第57页 |
| ·3T3-L1小鼠前体脂肪细胞系以及C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系的培养与诱导分化 | 第57页 |
| ·瞬时转染试验 | 第57页 |
| ·双荧光素酶活性的测定 | 第57-58页 |
| 7 结果与分析 | 第58-72页 |
| ·构建pGL3-Promoter-adi-pro与pGL3-Enhancer-adi-pro真核表达载体的试验 | 第58-59页 |
| ·pGL3-Promoter-adi-pro与pGL3-Enhancer-adi-pro真核表达载体的构建方案 | 第58页 |
| ·双酶切pGL3-Promoter-adi-pro,pGL3-Enhancer-adi-pro质粒结果 | 第58-59页 |
| ·转染非组成型启动子的试验结果 | 第59-60页 |
| ·组建CMV-adi-pro嵌合启动子的试验 | 第60-65页 |
| ·组建CMV-adi-pro嵌合启动子的载体构建方案 | 第60-61页 |
| ·CMV片段PCR扩增结果 | 第61-62页 |
| ·带有Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的adi-pro片段扩增结果 | 第62-65页 |
| ·组建SVenh-adi-pro嵌合启动子的试验 | 第65-67页 |
| ·组建SVenh-adi-pro嵌合启动子的载体构建方案 | 第65页 |
| ·SVenh片段的扩增结果 | 第65-66页 |
| ·双酶切pMD-18T-SVenh质粒结果 | 第66-67页 |
| ·转染细胞荧光测定结果 | 第67-72页 |
| ·第一组质粒荧光测定结果 | 第67-69页 |
| ·第二组质粒荧光测定结果 | 第69-71页 |
| ·不同嵌合启动子活性比较 | 第71-72页 |
| 结论 | 第72-73页 |
| 讨论 | 第73-76页 |
| 附录 | 第76-79页 |
| 参考文献 | 第79-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
