| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-19页 |
| 1 前言 | 第12页 |
| 2 启动子的结构特点及分类 | 第12-13页 |
| 3 组织特异性启动子在应用的过程中存在的问题及解决的方法 | 第13-15页 |
| 4 启动子结构和功能的研究方法 | 第15-16页 |
| ·启动子结构的研究方法 | 第15页 |
| ·启动子功能的验证 | 第15-16页 |
| 5 慢病毒载体在组织特异性启动子的活体验证中的应用 | 第16-17页 |
| 6 骨骼肌特异性表达基因α-actin的研究进展 | 第17-18页 |
| 7 研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 材料和方法 | 第19-41页 |
| 1 试验材料 | 第19-24页 |
| ·DNA样品 | 第19页 |
| ·所用试剂及药品 | 第19-20页 |
| ·所用载体和细胞 | 第20-23页 |
| ·常用试剂的配制 | 第23-24页 |
| ·细胞培养所用试剂的配制 | 第23页 |
| ·荧光素酶活性检测所需试剂的配制 | 第23-24页 |
| ·主要生物学软件 | 第24页 |
| 2 试验方法 | 第24-41页 |
| ·猪α-actin基因启动子的分离及功能验证 | 第24-34页 |
| ·猪α-actin基因上游调控序列的获得 | 第24页 |
| ·缺失片段的引物设计 | 第24-26页 |
| ·PCR产物的检测、回收及纯化 | 第26页 |
| ·PCR产物的检测 | 第26页 |
| ·PCR产物的回收及纯化 | 第26页 |
| ·PCR产物的加尾及纯化 | 第26-27页 |
| ·PCR产物的克隆及测序 | 第27-28页 |
| ·载体连接 | 第27页 |
| ·连接产物的转化 | 第27页 |
| ·阳性克隆的筛选及测序 | 第27-28页 |
| ·T1-T8的小量提取及酶切回收 | 第28-29页 |
| ·T1-T8的小量提取 | 第28-29页 |
| ·T1-T8的双酶切及缺失片段的回收 | 第29页 |
| ·pGL3-basic-Q1-pGL3-basic-Q8的构建 | 第29-31页 |
| ·缺失片段同pGL3-basic载体的连接、重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定 | 第29-30页 |
| ·pGL3-basic-Q1-pGL3-basic-Q8可用于细胞转染的质粒的小量提取 | 第30-31页 |
| ·pGL3-basic-Q1-pGL3-basic-Q8的双酶切及测序鉴定 | 第31页 |
| ·C2C12细胞系及猪的PK细胞的培养 | 第31-32页 |
| ·冻存细胞的复苏 | 第31页 |
| ·细胞的培养和传代 | 第31-32页 |
| ·细胞的冻存 | 第32页 |
| ·C2C12细胞的诱导分化 | 第32页 |
| ·细胞的转染 | 第32-33页 |
| ·双荧光素酶活性的检测 | 第33-34页 |
| ·细胞的裂解 | 第33-34页 |
| ·双荧光素酶活性的检测 | 第34页 |
| ·数据的处理及分析 | 第34页 |
| ·双启动子的构建及表达活性、组织特异性的鉴定 | 第34-38页 |
| ·双启动子的构建 | 第34-38页 |
| ·CMV、SV40及α-actin核心启动子的扩增 | 第34-35页 |
| ·TA克隆重组质粒的小量提取及酶切回收 | 第35-36页 |
| ·CMV、SV40的pGL3-basic重组载体的小量提取及酶切鉴定 | 第36页 |
| ·双启动子的重组质粒pGL3-basic的小量提取及酶切鉴定 | 第36-38页 |
| ·双启动子驱动的荧光素酶活性及组织特异性的检测 | 第38页 |
| ·慢病毒重组载体pLenti7.3/V5-GW的构建 | 第38-41页 |
| ·RFP的重组载体pMD18-T的构建 | 第38-39页 |
| ·Q8同RFP的嵌合片段的获得 | 第39页 |
| ·重组载体pLenti7.3的构建 | 第39-41页 |
| 第三章 结果与分析 | 第41-62页 |
| 1 猪α-actin启动子的克隆及功能分析 | 第41-50页 |
| ·猪α-actin启动子的生物信息学分析 | 第41-43页 |
| ·猪α-actin启动子的获得 | 第41页 |
| ·猪α-actin启动子结构的生物信息学预测 | 第41-43页 |
| ·猪α-actin启动子的重组载体PGL3-basic的构建 | 第43-47页 |
| ·猪α-actin启动子缺失片段的获得 | 第43-44页 |
| ·T1-T8的构建及酶切回收 | 第44-45页 |
| ·pGL3-basic-Q1--pGL3-basic-Q8的构建及酶切鉴定 | 第45-47页 |
| ·C2C12的诱导分化 | 第47页 |
| ·Q1-Q8驱动的荧光素酶活性的检测 | 第47-50页 |
| 2 双启动子的构建及其驱动下的LUC活性、组织特异性的检测 | 第50-58页 |
| ·CMV、SV40启动子的克隆 | 第50-51页 |
| ·双启动子的构建 | 第51-54页 |
| ·双启动子驱动下的LUC活性及组织特异性的检测 | 第54-58页 |
| 3 慢病毒重组载体pLenti7.3的构建 | 第58-62页 |
| ·RFP的扩增及其重组载体TA-R的构建 | 第58-59页 |
| ·重组载体Q8-R的构建及酶切鉴定 | 第59-60页 |
| ·重组载体pLenti7.3的构建及酶切鉴定 | 第60-62页 |
| 第四章 讨论 | 第62-68页 |
| 1 启动子的获得及功能的细胞水平的验证 | 第62页 |
| 2 双荧光素酶报告系统在启动子研究中的应用 | 第62-63页 |
| 3 关于组织特异性调控元件筛选的策略 | 第63-64页 |
| 4 关于改善启动子活性的研究策略 | 第64-65页 |
| 5 猪α-actin启动子活性的分析 | 第65-68页 |
| ·猪α-actin启动子结构的生物信息学分析 | 第65-66页 |
| ·猪α-actin启动子在C2C12、PK及分化的C1C12细胞中的活性 | 第66-67页 |
| ·双启动子在PK及分化的C1C12细胞中的活性分析 | 第67-68页 |
| 第五章 小结 | 第68-70页 |
| 1 本研究获得的结果 | 第68-69页 |
| 2 下一步的工作 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-76页 |
| 附录1: 2006bp的上游模板序列 | 第76-77页 |
| 附录2: pGL3.basic/Q1-Q8重组质粒序列 | 第77-81页 |
| 附录3: 四种双启动子重组质粒序列 | 第81-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
