| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-20页 |
| 1.1 前言 | 第12-13页 |
| 1.2 丝状真菌几丁质合酶基因研究进展 | 第13-16页 |
| 1.2.1 丝状真菌中几丁质合酶Ⅲ类基因研究进展 | 第14-15页 |
| 1.2.2 丝状真菌中几丁质合酶Ⅴ和Ⅵ类基因研究进展 | 第15-16页 |
| 1.3 丝状真菌中基因敲除技术研究进展 | 第16-19页 |
| 1.3.1 基因敲除概念和原理 | 第16-17页 |
| 1.3.2 丝状真菌基因敲除研究进展 | 第17-19页 |
| 1.4 选题意义 | 第19-20页 |
| 第二章 灰葡萄孢几丁质合酶Ⅵ基因敲除突变株的构建及鉴定 | 第20-38页 |
| 2.1 材料 | 第20-23页 |
| 2.1.1 供试菌株 | 第20页 |
| 2.1.2 主要培养基 | 第20-22页 |
| 2.1.3 主要供试试剂和仪器 | 第22页 |
| 2.1.4 载体和引物 | 第22-23页 |
| 2.2 方法 | 第23-35页 |
| 2.2.1 重组质粒pETHG-C6D的构建 | 第23-26页 |
| 2.2.1.1 克隆BcChsVI基因上下游片段 | 第23-24页 |
| 2.2.1.2 纯化PCR产物 | 第24页 |
| 2.2.1.3 C6D片段的TA克隆 | 第24-25页 |
| 2.2.1.4 构建重组质粒pETHG-C6D | 第25-26页 |
| 2.2.2 入门载体pETHG-C6U-C6D的构建 | 第26页 |
| 2.2.2.1 C6D片段的TA克隆 | 第26页 |
| 2.2.2.2 重组入门载体pETHG-C6U-C6D | 第26页 |
| 2.2.3 双元载体pCAMBIA-Bar-chs6的构建 | 第26-28页 |
| 2.2.4 双元载体pCAMBIA-Bar-chs6转入农杆菌AGL-1感受态细胞 | 第28页 |
| 2.2.5 根癌农杆菌AGL-1介导的灰葡萄孢转化 | 第28-29页 |
| 2.2.5.1 菌株的活化和培养 | 第28页 |
| 2.2.5.2 农杆菌AGL-1介导的灰葡萄孢转化 | 第28-29页 |
| 2.2.5.3 灰葡萄孢Bcchs6突变株的保种 | 第29页 |
| 2.2.6 灰葡萄孢Bcchs6突变株的鉴定 | 第29-35页 |
| 2.2.6.1 利用引物对ChsF1-ChsR1进行PCR鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.6.2 利用引物对ChsF1-HptR进行PCR鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.6.3 利用引物对ChsF2- ChsR2进行RT～PCR鉴定 | 第32-35页 |
| 2.3 结果与分析 | 第35-36页 |
| 2.4 小结 | 第36-38页 |
| 第三章 灰葡萄孢B05.10中BcChsⅥ基因功能的研究 | 第38-50页 |
| 3.1 材料 | 第38-39页 |
| 3.1.1 供试菌株 | 第38页 |
| 3.1.2 主要培养基 | 第38页 |
| 3.1.3 主要供试试剂和仪器 | 第38-39页 |
| 3.2 方法 | 第39-43页 |
| 3.2.1 表型观察和生长速率测定 | 第39-40页 |
| 3.2.2 药物敏感性测定 | 第40页 |
| 3.2.3 山梨醇挽救实验 | 第40页 |
| 3.2.4 Bcchs6突变株几丁质含量测定 | 第40-42页 |
| 3.2.4.1 分光光度计法制作葡萄胺含量标准曲线 | 第40-41页 |
| 3.2.4.2 测定Bcchs6突变株中几丁质含量 | 第41-42页 |
| 3.2.5 Bcchs6突变株致病性检测 | 第42-43页 |
| 3.3 结果与分析 | 第43-49页 |
| 3.3.1 Bcchs6突变株表型和生长速率 | 第43-45页 |
| 3.3.1.1 Bcchs6突变株表型 | 第43-45页 |
| 3.3.1.2 Bcchs6突变株生长速率 | 第45页 |
| 3.3.2 药物敏感性实验结果 | 第45-46页 |
| 3.3.3 山梨醇挽救实验 | 第46-47页 |
| 3.3.4 葡萄胺含量标准曲线的制作 | 第47页 |
| 3.3.5 测定Bcchs6突变株几丁质含量 | 第47-48页 |
| 3.3.6 Bcchs6突变株致病性检测 | 第48-49页 |
| 3.4 小结 | 第49-50页 |
| 第四章 灰葡萄孢Bcchs6突变株遗传互补的研究 | 第50-68页 |
| 4.1 材料 | 第50-51页 |
| 4.1.1 供试菌株 | 第50页 |
| 4.1.2 主要培养基 | 第50页 |
| 4.1.3 主要供试试剂和仪器 | 第50-51页 |
| 4.1.4 载体和引物 | 第51页 |
| 4.2 方法 | 第51-61页 |
| 4.2.1 高保真酶扩增几丁质合酶BcChsⅥ基因全序列 | 第51-53页 |
| 4.2.2 几丁质合酶BcChsⅥ基因的TA克隆 | 第53-57页 |
| 4.2.2.1 目的基因的切胶回收 | 第53页 |
| 4.2.2.2 目的基因的TA克隆 | 第53-57页 |
| 4.2.3 重组质粒pETHG-BcChsⅥ | 第57-58页 |
| 4.2.3.1 获取入门载体pETHG | 第57-58页 |
| 4.2.3.2 重组质粒pETHG-BcChsⅥ的构建 | 第58页 |
| 4.2.3.3 重组质粒pETHG-BcChsⅥ的鉴定 | 第58页 |
| 4.2.4 构建双元载体pCAMBIA-Bar-BcChsⅥ | 第58-60页 |
| 4.2.4.1 获取目的载体pCAMBIA-Bar-RfA | 第58-59页 |
| 4.2.4.2 LR反应 | 第59页 |
| 4.2.4.3 双元载体pCAMBIA-Bar-BcChsⅥ的获得 | 第59页 |
| 4.2.4.4 双元载体pCAMBIA-Bar-BcChsⅥ转化农杆菌AGL-1感受态细胞 | 第59-60页 |
| 4.2.5 根癌农杆菌AGL-1介导的灰葡萄孢转化 | 第60-61页 |
| 4.2.5.1 菌株的活化和培养 | 第60页 |
| 4.2.5.2 农杆菌AGL-1介导的灰葡萄孢转化 | 第60-61页 |
| 4.2.5.3 互补转化子的保种 | 第61页 |
| 4.2.6 互补转化子的生物学特性分析 | 第61页 |
| 4.3 结果与分析 | 第61-66页 |
| 4.3.1 几丁质合酶BcChsⅥ基因全序列的扩增 | 第61-62页 |
| 4.3.2 目的基因BcChsⅥ的TA克隆 | 第62-63页 |
| 4.3.3 重组质粒pETHG-BcChsⅥ的构建 | 第63-64页 |
| 4.3.4 双元载体pCAMBIA-Bar-BcChsⅥ的构建 | 第64-65页 |
| 4.3.5 互补转化子的获得及生物学特性分析 | 第65-66页 |
| 4.4 小结 | 第66-68页 |
| 第五章 总结与展望 | 第68-70页 |
| 5.1 总结 | 第68-69页 |
| 5.2 展望 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第78页 |
