| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-24页 |
| 第一章 植物腺苷5'-磷酰硫酸激酶(APSK)的研究进展进展 | 第13-21页 |
| 1 腺苷5'-磷酰硫酸激酶(APSK)简介 | 第13-14页 |
| 2 植物硫酸盐的活化 | 第14-16页 |
| 3 植物腺苷5-磷酸-硫酸激酶（APSK)的结构 | 第16-17页 |
| 4 APSK的反应机理与重组酶的动力学分析 | 第17-20页 |
| 4.1 APSK的反应机理 | 第17-18页 |
| 4.2 APSK重组酶的动力学分析 | 第18-20页 |
| 5 APSK的氧化还原调控 | 第20-21页 |
| 第二章 研究目的及意义 | 第21-24页 |
| 技术路线 | 第22-24页 |
| 第二部分 研究内容 | 第24-67页 |
| 第一章 水稻APSK及其突变体在氧化还原环境中的活性分析 | 第24-48页 |
| 1 前言 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-26页 |
| 2.1 酶与生化试剂 | 第25页 |
| 2.2 菌株与载体 | 第25-26页 |
| 3 实验方法 | 第26-35页 |
| 3.1 水稻APSK突变体表达载体的构建及活性测定 | 第26-29页 |
| 3.1.1 突变位点的确定以及设计定点突变引物生理分析 | 第26页 |
| 3.1.2 质粒提取 | 第26-27页 |
| 3.1.3 突变PCR扩增 | 第27页 |
| 3.1.4 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第27-28页 |
| 3.1.5 BL21菌株感受态细胞制备 | 第28-29页 |
| 3.1.6 PCR验证 | 第29页 |
| 3.1.7 菌液的保存与测序 | 第29页 |
| 3.2 APSK突变蛋白的表达与纯化 | 第29-35页 |
| 3.2.1 APSK突变体C77、C168、C212的蛋白诱导表达 | 第29-30页 |
| 3.2.2 水稻APSK1突变蛋白的纯化 | 第30页 |
| 3.2.3 透析袋的处理 | 第30-31页 |
| 3.2.4 蛋白透析 | 第31页 |
| 3.2.5 蛋白标签的去除 | 第31-32页 |
| 3.2.6 SDS-PAGE电泳 | 第32-34页 |
| 3.2.7 蛋白浓度测定 | 第34-35页 |
| 3.3 水稻APSK1突变蛋白活性测定 | 第35页 |
| 4 水稻APSK1启动子序列分析 | 第35-36页 |
| 5 实验结果 | 第36-45页 |
| 5.1 不同物种APSK1序列比对结果 | 第36页 |
| 5.2 水稻APSK基因的突变 | 第36-39页 |
| 5.3 水稻APSK突变菌株的PCR验证及测序 | 第39-40页 |
| 5.4 水稻APSK突变(c77、c168、c212)蛋白的表达与纯化 | 第40页 |
| 5.5 SDS-PAGE电泳检测蛋白表达 | 第40-41页 |
| 5.6 启动子序列分析 | 第41-43页 |
| 5.6.1 启动子预测 | 第41页 |
| 5.6.2 顺式原件分析 | 第41-43页 |
| 5.7 目的蛋白的定量 | 第43-44页 |
| 5.8 水稻APSK突变体的APS磷酸化化活性测定 | 第44-45页 |
| 6 讨论 | 第45-48页 |
| 第二章 嗜热苍白空气芽孢杆菌中APSK的基因克隆、蛋白表达纯化及活性分析 | 第48-67页 |
| 1 前言 | 第48-49页 |
| 2 材料与试剂 | 第49页 |
| 2.1 酶与试剂 | 第49页 |
| 2.2 菌株与载体 | 第49页 |
| 3 实验方法 | 第49-59页 |
| 3.1 嗜热苍白芽孢杆菌基因组DNA的提取 | 第49-50页 |
| 3.2 pET24a-ApAPSK表达载体的构建 | 第50-54页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第50页 |
| 3.2.2 PCR扩增 | 第50-51页 |
| 3.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第51页 |
| 3.2.4 PCR产物纯化 | 第51-52页 |
| 3.2.5 PCR产物连接 | 第52页 |
| 3.2.6 E.coli DH5α感受态细胞制备 | 第52-53页 |
| 3.2.7 连接产物转入E.coli.DH5α感受态细胞 | 第53页 |
| 3.2.8 PCR及酶切验证 | 第53页 |
| 3.2.9 保存菌液及测序 | 第53-54页 |
| 3.3 双酶切载体pET24a和质粒pMD-19T-simple-ApAPSK | 第54页 |
| 3.4 割胶回收 | 第54-55页 |
| 3.5 构建重组质粒pET24a-ApAPSK | 第55页 |
| 3.6 蛋白表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞的制备 | 第55页 |
| 3.7 连接产物pET24a-ApAPSK转化表达菌株 | 第55-56页 |
| 3.8 嗜热菌APSK蛋白的表达纯化 | 第56-59页 |
| 3.8.1 蛋白的诱导表达 | 第56页 |
| 3.8.2 嗜热菌APSK的纯化 | 第56-57页 |
| 3.8.3 SDS-PAGE电泳 | 第57页 |
| 3.8.4 蛋白质浓度测定及其浓缩 | 第57页 |
| 3.8.5 嗜热菌APSK活性测定 | 第57-59页 |
| 4 实验结果 | 第59-65页 |
| 4.1 嗜热菌APSK基因克隆 | 第59-60页 |
| 4.1.1 引物设计 | 第59页 |
| 4.1.2 PCR产物电泳检测 | 第59-60页 |
| 4.2 克隆载体pMD-19T-ApAPSK的构建 | 第60-61页 |
| 4.3 重组质粒pET24a-ApAPSK的构建 | 第61页 |
| 4.4 嗜热菌APSK蛋白的诱导表达及纯化 | 第61-62页 |
| 4.5 目的蛋白的定量 | 第62-63页 |
| 4.6 目的蛋白APSK活性分析 | 第63-65页 |
| 4.6.1 嗜热菌APSK的APS磷酸化活性测定 | 第63页 |
| 4.6.2 ApAPSK的最适PH分析 | 第63-65页 |
| 4.6.3 ApAPSK的最适反应温度分析 | 第65页 |
| 4.6.4 ApAPSK的热稳定性分析 | 第65页 |
| 5 讨论 | 第65-67页 |
| 结论与展望 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-75页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76-78页 |
