| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第16-32页 |
| 1.1 概述 | 第16-17页 |
| 1.1.1 酿酒酵母钴离子耐受性的意义 | 第16页 |
| 1.1.2 酿酒酵母对硒、铬与钴离子耐受性的研究方法 | 第16-17页 |
| 1.1.3 通过细胞保护系统研究钴离子耐受性 | 第17页 |
| 1.2 细胞壁 | 第17-22页 |
| 1.2.1 细胞壁的分子结构 | 第18-19页 |
| 1.2.2 细胞壁的功能 | 第19-20页 |
| 1.2.3 细胞壁完整性通路 | 第20-22页 |
| 1.3 细胞膜 | 第22-24页 |
| 1.3.1 细胞膜结构和功能 | 第22-23页 |
| 1.3.2 麦角固醇生物合成途径 | 第23-24页 |
| 1.4 还原型谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸生物合成代谢途径 | 第24-27页 |
| 1.4.1 GSH的生物合成代谢途径 | 第24-26页 |
| 1.4.2 SAM的生物合成代谢途径 | 第26-27页 |
| 1.5 CRISPR-Cas9系统 | 第27-28页 |
| 1.5.1 真核生物的基因编辑技术 | 第27页 |
| 1.5.2 真核生物CRISPR-Cas9系统 | 第27-28页 |
| 1.5.3 酿酒酵母CRISPR-Cas9系统 | 第28页 |
| 1.6 存在的问题及展望 | 第28页 |
| 1.7 本论文的研究思路 | 第28-32页 |
| 第二章 敲除菌株和表达菌株的构建 | 第32-52页 |
| 2.1 引言 | 第32页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第32-37页 |
| 2.2.1 质粒与菌株 | 第32-36页 |
| 2.2.2 引物 | 第36页 |
| 2.2.3 培养基 | 第36页 |
| 2.2.4 实验仪器 | 第36页 |
| 2.2.5 酿酒酵母醋酸锂化转方法 | 第36-37页 |
| 2.3 敲除菌株构建 | 第37-42页 |
| 2.3.1 CRISPR-Cas9原理图 | 第37页 |
| 2.3.2 sgRNA敲除质粒和HDR修复模板的构建 | 第37-41页 |
| 2.3.3 ERG4、ERG6、FKS2和SAM2敲除结果分析 | 第41-42页 |
| 2.4 表达菌株构建 | 第42-51页 |
| 2.4.1 Yeplac181-1701质粒构建 | 第42-43页 |
| 2.4.2 Yeplac181-1702,1703,1704表达质粒构建 | 第43-47页 |
| 2.4.3 Yeplac181-1705表达质粒构建 | 第47-48页 |
| 2.4.4 Yeplac181-1706,1707,1708表达质粒构建 | 第48-51页 |
| 2.4.5 32种表达菌株构建 | 第51页 |
| 2.5 本章小结 | 第51-52页 |
| 第三章 表达菌株中重组质粒的表达水平评估 | 第52-62页 |
| 3.1 引言 | 第52页 |
| 3.2 摇瓶发酵 | 第52-54页 |
| 3.2.1 菌株与培养基 | 第52-53页 |
| 3.2.2 培养方法 | 第53-54页 |
| 3.3 荧光显微镜检测 | 第54-56页 |
| 3.3.1 处理方法 | 第54页 |
| 3.3.2 荧光显微镜结果 | 第54-56页 |
| 3.4 流式细胞仪检测 | 第56-57页 |
| 3.4.1 处理方法 | 第56页 |
| 3.4.2 流式细胞仪结果 | 第56-57页 |
| 3.5 结果分析 | 第57-60页 |
| 3.5.1 5种菌株发酵的OD_(600nm)曲线 | 第57-58页 |
| 3.5.2 5种菌株中重组质粒表达水平的评估 | 第58-60页 |
| 3.6 本章小结 | 第60-62页 |
| 第四章 酿酒酵母钴离子的耐受性评估 | 第62-74页 |
| 4.1 引言 | 第62页 |
| 4.2 摇瓶发酵 | 第62-63页 |
| 4.2.1 菌种与培养基 | 第62页 |
| 4.2.2 培养方法 | 第62页 |
| 4.2.3 钴离子耐受性定义 | 第62-63页 |
| 4.3 谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸的检测方法 | 第63-64页 |
| 4.3.1 GSH的高效液相检测方法 | 第63页 |
| 4.3.2 SAM的高效液相检测方法 | 第63-64页 |
| 4.4 钴离子耐受性评估 | 第64-73页 |
| 4.4.1 原始菌株对不同浓度的钴离子耐受性 | 第64-65页 |
| 4.4.2 32种菌株发酵的OD_(600nm)曲线 | 第65-66页 |
| 4.4.3 在WT中过表达各基因 | 第66-67页 |
| 4.4.4 在fks2△中过表达各基因 | 第67-68页 |
| 4.4.5 在sam2△中过表达各基因 | 第68-69页 |
| 4.4.6 在erg4△&erg6△中过表达各基因 | 第69-70页 |
| 4.4.7 32种菌株GSH和SAM的含量 | 第70-71页 |
| 4.4.8 结果分析 | 第71-73页 |
| 4.5 本章小结 | 第73-74页 |
| 第五章 结论与展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-82页 |
| 附录 | 第82-92页 |
| 附录一 本文构建质粒所需要的引物 | 第82-86页 |
| 附录二 常用的培养基及实验试剂 | 第86-88页 |
| 附录三 PCR扩增、酶切及连接体系 | 第88-90页 |
| 附录四 常用实验仪器设备 | 第90-92页 |
| 致谢 | 第92-94页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第94-96页 |
| 作者及导师简介 | 第96-97页 |
| 附件 | 第97-98页 |
