| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 引言 | 第14-19页 |
| 1.1 斑节对虾简介 | 第14页 |
| 1.2 热休克蛋白家族简介 | 第14-15页 |
| 1.3 热休克蛋白Hsp90和Cdc37简介 | 第15-18页 |
| 1.3.1 Hsp90和Cdc37结构与功能 | 第15-17页 |
| 1.3.2 Hsp90和Cdc37在甲壳动物中的研究进展 | 第17-18页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 PmCdc37基因的克隆和表达分布 | 第19-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-23页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第19页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第19-21页 |
| 2.1.3 实验试剂与配制 | 第21-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-33页 |
| 2.2.1 总RNA提取和cDNA的合成 | 第23-24页 |
| 2.2.2 PmCdc37cDNA全长的克隆 | 第24-30页 |
| 2.2.2.1 PmCdc37引物的设计 | 第25页 |
| 2.2.2.2 PmCdc37开放阅读框的验证 | 第25-26页 |
| 2.2.2.3 PCR产物切胶回收 | 第26-27页 |
| 2.2.2.4 胶回收产物连接 | 第27页 |
| 2.2.2.5 转化 | 第27页 |
| 2.2.2.6 挑取单克隆和菌液PCR检测 | 第27-28页 |
| 2.2.2.7 RACEPCR克隆PmCdc37基因3'端 | 第28-30页 |
| 2.2.3 序列分析与系统进化树的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.4 PmCdc37组织表达分析 | 第31-33页 |
| 2.2.4.1 各组织定量模板逆转录合成 | 第31页 |
| 2.2.4.2 实时荧光定量PCR | 第31-33页 |
| 2.3 实验结果 | 第33-38页 |
| 2.3.1 PmCdc37基因的克隆与结构特征分析 | 第33-35页 |
| 2.3.2 PmCdc37系统发育分析 | 第35-38页 |
| 2.3.3 PmCdc37的表达分布 | 第38页 |
| 2.4 讨论 | 第38-40页 |
| 第三章 PmHsp90和PmCdc37蛋白表达及功能分析 | 第40-54页 |
| 3.1 实验材料 | 第40-41页 |
| 3.1.1 实验动物 | 第40页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第40页 |
| 3.1.3 实验试剂与配制 | 第40-41页 |
| 3.2 实验方法 | 第41-50页 |
| 3.2.1 PmHsp90和PmCdc37重组表达 | 第41-45页 |
| 3.2.1.1 PmHsp90和PmCdc37基因ORF的获取 | 第41-42页 |
| 3.2.1.2 琼脂糖凝胶回收纯化 | 第42页 |
| 3.2.1.3 质粒与目的基因的双酶切 | 第42-43页 |
| 3.2.1.4 连接 | 第43页 |
| 3.2.1.5 转化 | 第43页 |
| 3.2.1.6 挑取单克隆和菌液PCR检测 | 第43页 |
| 3.2.1.7 PmHsp90和PmCdc37质粒提取 | 第43-44页 |
| 3.2.1.8 重组质粒转化 | 第44页 |
| 3.2.1.9 单克隆选取与菌液检测 | 第44-45页 |
| 3.2.2 PmHsp90和PmCdc37蛋白的诱导表达与检测 | 第45-46页 |
| 3.2.2.1 PmHsp90和PmCdc37的诱导表达 | 第45页 |
| 3.2.2.2 SDS-PAGE检测 | 第45-46页 |
| 3.2.2.3 蛋白免疫印迹 | 第46页 |
| 3.2.3 PmHsp90和PmCdc37蛋白的纯化 | 第46-48页 |
| 3.2.3.1 蛋白纯化原理 | 第46-47页 |
| 3.2.3.2 蛋白纯化步骤 | 第47页 |
| 3.2.3.3 蛋白浓度检测原理 | 第47-48页 |
| 3.2.3.4 蛋白浓度检测步骤 | 第48页 |
| 3.2.4 PmHsp90和PmCdc37多克隆抗体的制备 | 第48页 |
| 3.2.5 Hsp90ATPase活性的测定 | 第48-50页 |
| 3.2.5.1 ATPase活性的测定原理 | 第48-49页 |
| 3.2.5.2 PmHsp90ATPase活性的测定步骤 | 第49-50页 |
| 3.3 实验结果 | 第50-52页 |
| 3.3.1 PmHsp90和PmCdc37蛋白表达及纯化 | 第50-51页 |
| 3.3.2 PmHsp90ATPase活性 | 第51-52页 |
| 3.4 讨论 | 第52-54页 |
| 第四章 PmHsp90及伴侣因子PmCdc37在镉应激下的功能分析 | 第54-71页 |
| 4.1 实验材料 | 第54-55页 |
| 4.1.1 实验动物 | 第54页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第54页 |
| 4.1.3 实验试剂与配制 | 第54-55页 |
| 4.2 实验方法 | 第55-62页 |
| 4.2.1 镉应激实验 | 第55-56页 |
| 4.2.1.1 取样 | 第55页 |
| 4.2.1.2 总RNA提取和定量模板的合成逆转录 | 第55页 |
| 4.2.1.3 实时荧光定量PCR | 第55-56页 |
| 4.2.2 总蛋白的提取和WB检测 | 第56-57页 |
| 4.2.2.1 镉应激后血淋巴总蛋白的提取 | 第56页 |
| 4.2.2.2 总蛋白浓度的检测 | 第56页 |
| 4.2.2.3 镉应激后PmHsp90和PmCdc37蛋白水平的检测 | 第56-57页 |
| 4.2.3 TAT-PmHsp90和TAT-PmCdc37重组载体的构建 | 第57-59页 |
| 4.2.3.1 TAT-PmHsp90和TAT-PmCdc37基因ORF的获取 | 第57-58页 |
| 4.2.3.2 琼脂糖凝胶回收纯化 | 第58页 |
| 4.2.3.3 质粒与目的基因的双酶切 | 第58-59页 |
| 4.2.3.4 连接 | 第59页 |
| 4.2.3.5 转化 | 第59页 |
| 4.2.3.6 挑取单克隆和菌液PCR检测 | 第59页 |
| 4.2.4 TAT-PmHsp90和TAT-PmCdc37诱导表达 | 第59页 |
| 4.2.5 TAT-PmHsp90和TAT-PmCdc37蛋白纯化及浓度检测 | 第59-60页 |
| 4.2.5.1 TAT-PmHsp90和TAT-PmCdc37蛋白纯化 | 第59-60页 |
| 4.2.5.2 TAT-PmHsp90和TAT-PmCdc37蛋白浓度测定 | 第60页 |
| 4.2.6 siRNA-PmHsp90和siRNA-PmCdc37的合成和筛选 | 第60页 |
| 4.2.7 镉应激下的PmHsp90和PmCdc37注射重组蛋白实验 | 第60页 |
| 4.2.8 镉应激下的PmHsp90和PmCdc37抑制实验 | 第60-62页 |
| 4.2.8.1 siRNA-PmHsp90和siRNA-PmCdc37注射实验 | 第60-61页 |
| 4.2.8.2 总RNA的提取和定量模板的合成 | 第61页 |
| 4.2.8.3 实时荧光定量PCR | 第61页 |
| 4.2.8.4 镉应激下注射siRNA-PmHsp90和siRNA-PmCdc37累计死亡率实验 | 第61页 |
| 4.2.8.5 镉应激下注射雷公藤红素累积死亡率实验 | 第61-62页 |
| 4.2.9 总蛋白的提取和WB检测 | 第62页 |
| 4.3 实验结果 | 第62-69页 |
| 4.3.1 PmHsp90和PmCdc37在镉应激下的表达变化 | 第62-65页 |
| 4.3.2 PmHsp90和PmCdc37干扰后的表达变化 | 第65-67页 |
| 4.3.3 斑节对虾在镉应激下累计死亡率 | 第67-69页 |
| 4.4 讨论 | 第69-71页 |
| 第五章 PmHsp90和伴侣因子PmCdc37对SOD活性的影响以及SOD在镉应激下的功能分析 | 第71-84页 |
| 5.1 实验材料 | 第71页 |
| 5.1.1 实验仪器 | 第71页 |
| 5.1.2 实验试剂与配制 | 第71页 |
| 5.2 实验方法 | 第71-78页 |
| 5.2.1 SOD和MDA酶活检测 | 第71-73页 |
| 5.2.1.1 样品的收集 | 第71-72页 |
| 5.2.1.2 SOD酶活性检测 | 第72页 |
| 5.2.1.3 MDA含量检测 | 第72-73页 |
| 5.2.2 PmSOD和TAT-PmSOD的重组载体的构建 | 第73-75页 |
| 5.2.2.1 PmSOD和TAT-PmSOD基因ORF的获取 | 第73-74页 |
| 5.2.2.2 琼脂糖凝胶回收纯化 | 第74页 |
| 5.2.2.3 质粒与目的基因的双酶切 | 第74页 |
| 5.2.2.4 连接 | 第74-75页 |
| 5.2.2.5 转化 | 第75页 |
| 5.2.2.6 挑取单克隆和菌液PCR检测 | 第75页 |
| 5.2.3 PmSOD和TAT-PmSOD诱导表达 | 第75页 |
| 5.2.4 PmSOD和TAT-PmSOD蛋白纯化及蛋白浓度检测 | 第75-76页 |
| 5.2.4.1 PmSOD和TAT-PmSOD蛋白纯化 | 第75-76页 |
| 5.2.4.2 PmSOD和TAT-PmSOD蛋白浓度测定 | 第76页 |
| 5.2.5 siRNA-PmSOD的合成和筛选 | 第76页 |
| 5.2.6 在镉应激下检测PmSODmRNA表达变化 | 第76页 |
| 5.2.7 镉应激下TAT-PmSOD注射重组蛋白实验 | 第76-77页 |
| 5.2.8 siRNA-PmSOD干扰实验 | 第77-78页 |
| 5.2.8.1 siRNA-SOD的注射实验 | 第77页 |
| 5.2.8.2 总RNA的提取和定量模板的合成 | 第77页 |
| 5.2.8.3 实时荧光定量PCR | 第77页 |
| 5.2.8.4 镉应激下注射siRNA-PmSOD累积死亡率实验 | 第77-78页 |
| 5.3 实验结果 | 第78-82页 |
| 5.3.0 SOD和MDA酶活 | 第78-79页 |
| 5.3.1 PmSOD蛋白表达及纯化 | 第79页 |
| 5.3.2 镉应激下PmSODmRNA表达变化 | 第79-80页 |
| 5.3.3 PmSOD干扰后的表达变化 | 第80-81页 |
| 5.3.4 镉应激下累积死亡率 | 第81-82页 |
| 5.4 讨论 | 第82-84页 |
| 结论 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-90页 |
| 附录 | 第90-91页 |
| 致谢 | 第91页 |
